[发明专利]利用液相色谱串联质谱测定血红蛋白浓度的方法

说明书

技术领域

本发明涉及仪器分析技术领域，具体涉及利用液相色谱和质谱测定血液中血红蛋白浓度的方法，尤其能测定微量且经较长时间保存的血液标本血红蛋白的浓度。

背景技术

血红蛋白作为红细胞内的一种机能蛋白，氧气结合在铁原子上，被血液运输。血红蛋白在生物体内，起传输氧气、分解H₂O₂、传递电子等与氧和能量代谢有关的重要活动。由于临床上白血病、贫血及心脏病等常伴有血红蛋白异常，因此，人血清中血红蛋白含量的测定是评价人体健康水平的一个重要指标。

已知，血红蛋白(Hemoglobin，Hb)由一个珠蛋白和四个血红素(又称亚铁原卟啉)组成，每个血红素又由四个吡咯类亚基组成一个环，环中心为一个亚铁离子。每个珠蛋白则有四条多肽链组成，珠蛋白的四条肽链各不相同。成年人可由2条α链和2条β链构成，称HbA，胎儿由2条α链2条γ链构成，称HbF，出生后不久由HbA取代。珠蛋白的每条多肽链与一个血红素连接，构成血红蛋白的一个单体，或者说亚单位(即亚基)。

基于此，人们建立了大量分析血红蛋白浓度的方法，包括光度法、荧光法、电化学法等。具体如：氰化高铁法(HiCN法)，其原理为：血红蛋白在高铁氰化钾和氰化钾的作用下，生成极为稳定的氰化高铁血红蛋白(红色)，其颜色深浅与血红蛋白的含量成正比；氰化高铁血红蛋白在540nm波长下，毫克分子消光系数为44，据此，用分光光度法测其吸光度，从而得出血红蛋白的定量测定。除此以外，还有如氧合血红蛋白法、各型血红蛋白仪测定等。

在遗传代谢病筛查、贫血以及营养改善状况等的普查中，往往涉及多个样本的采集。出于成本和可行性的考虑，对这些样本的测试难以及时进行，通常需累积一定样本后，到特定的地点集中进行测试。其间，由于样本的长期保存、长距离运输以及环境温湿度的影响，到测试时血红蛋白已经遭到破坏。由于上述已有方法均是基于血红蛋白结构完整情况下的生物活性或理化性质而进行的检测，当血液标本保持时间过长，可能发生溶血或血红蛋白裂解时，测定的结果就难以反映标本采集时血红蛋白的真实浓度，且实验操作繁琐，测试效率低。

液质联用(LC-MS)又叫液相色谱-质谱联用技术，它以液相色谱作为分离系统，质谱为检测系统。样品在质谱部分和流动相分离，被离子化后，经质谱的质量分析器将离子碎片按质量数分开，经检测器得到质谱图。液质联用体现了色谱和质谱优势的互补，将色谱对复杂样品的高分离能力，与MS具有高选择性、高灵敏度及能够提供相对分子质量与结构信息的优点结合起来，实现对复杂混合物更准确的定量和定性分析，而且也简化了样品的前处理过程，使样品分析更简便，因此广泛应用于药物分析、食品分析和环境分析等许多领域。

串联三重四级杆质谱仪对于液相色谱－质谱/质谱应用来说是权威的分析工具，分析者可以采用最少的样品制备步骤，对少量化合物进行高通量的定量分析。该质谱仪通过连续放置多个分析器来实现空间串联的多级质谱分析。每个分析器有以下单独的作用：第一个四极杆(Q1)根据设定的质荷比范围扫描和选择所需的离子；第二个四极杆(Q2)，也称碰撞池，用于聚集和传送离子，在所选择离子的飞行途中，引入碰撞气体，例如氮气等；第三个四极杆(Q3)用于分析在碰撞池中产生的碎片离子。在母离子扫描中，Q1测定母离子，Q2碰撞池产生碎片离子，Q3测定某个特定的碎片离子，因此可在非常复杂的混合物中监测某种特定的分子。

基于上述原因和现有技术，本发明探索了血红蛋白浓度测定的新方法。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种基于血红蛋白的裂解片段作为标志肽段在血红蛋白浓度测定中的应用。由于采用血红蛋白的裂解片段作为标志肽段进行测试，故不要求血红蛋白的构象完整，能测定微量且经较长时间保存的血液标本的血红蛋白浓度。

进一步，所述应用为采用质谱测定血红蛋白浓度中的应用。

进一步，所述应用为采用液相色谱串联质谱测定血红蛋白浓度中的应用。

进一步，所述标志肽段为SEQ ID NO：1～11中的一条或多条。

具体地，本发明提供一种测定血红蛋白浓度的方法，能测定微量且经较长时间保存的血液标本的血红蛋白浓度。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

一种测定血红蛋白浓度的方法，包括以下步骤：

A、取血红蛋白样品进行分解，得珠蛋白多肽链的裂解片段；

B、对所述裂解片段进行分离，以分离获得的一条或多条裂解片段为标志肽段，利用质谱进行定量测试；