[发明专利]一种利用金磁微粒纯化动物微量组织中总核酸的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用磁性纳微米材料纯化微量组织总核酸的方法。

背景技术

高质量核酸提取是许多分子生物学研究中至关重要的步骤，分子生物学实验研究对于核酸纯度和完整性等方面有较高要求。针对于动物组织的分析，包括疾病诊断、克隆、测序、扩增及杂交等诸多实验研究的核心是纯化得到高质量高浓度的核酸。随着分子生物学、临床医学和药物基因组学等学科的高速发展，总核酸纯化方法应用于肿瘤穿刺组织可实现对于穿刺组织总核酸的快速高效纯化，从而为患者的病理诊断、药物代谢基因研究及个体化用药研究等奠定基础。动物组织样本及人肿瘤穿刺组织样本通常较难得到，可用于纯化的样本质量较小；目前国内外对于微量组织总核酸纯化方法的相关研究较少，因此，关于针对微量组织的总核酸纯化方法的研究具有其重要意义。

目前国内外针对于动物组织核酸纯化的方法和试剂盒可归纳为两类：固相分离法和液相分离法。利用磁性微粒进行的核酸分离纯化属于固相分离法的一种，该方法操作简便、无需使用有毒性的有机试剂、纯化过程快速且得到的核酸质量高。OMEGA等公司开发的类似产品可从同一组织中分步得到RNA与基因组DNA，但是不能实现两者的同时提取，且价格昂贵，实验结果不稳定，难以得到普遍应用。

专利CN101724625A所涉及的总核酸的磁性微粒分离方法针对于大量组织(≥15mg)效果较好，但针对于微量组织(≤10mg)则不能实现高质量高浓度总核酸的分离纯化。

金磁微粒，即组装型磁性复合微粒及核/壳型超顺磁性复合微粒，其制备方法及结构组成已在中国专利ZL03153486.4和ZL03124061.5分别进行了公开，本发明即为基于金磁微粒所建立的快速高效、经济环保的微量组织总核酸纯化方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种快速高效、经济环保的基于金磁微粒的微量组织总核酸纯化方法，实现微量组织总核酸共同提取。

本发明的技术解决方案是：

一种利用金磁微粒纯化动物微量组织中总核酸的方法，其特征在于：整个纯化过程在无菌操作台完成，包括以下步骤：

(1)裂解样品

取待纯化样本，加入裂解液中，充分研磨至无固体组织存在的匀浆液(研磨组织的方式可根据具体情况选择，如液氮研磨法或使用自动匀浆机)，加入稀释液混匀备用；所述裂解液为终浓度为2M‐8M硫氰酸胍溶液与0.01‐0.05M柠檬酸钠的混合溶液，并在使用前以体积比25:1加入β‐巯基乙醇；

(2)形成含金磁微粒‐核酸复合物的混合溶液

取金磁微粒溶液置于一洁净离心管中，磁性分离后去除上清液，加入结合液后与步骤(1)得到的匀浆液混合均匀，室温下静置使其充分结合，形成含金磁微粒‐核酸复合物的混合溶液；

(3)将金磁微粒‐核酸复合物从混合溶液中分离

对混合溶液磁性分离，弃去管内液体(管内液体因含有组织成分而不澄清，属于正常情况)，管内的固体成分为所得到的金磁微粒‐核酸复合物；

(4)清洗

依次采用第一清洗液和第二清洗液对收集到的金磁微粒‐核酸复合物进行清洗，其中第一清洗液是终浓度为2M‐8M氯化锂溶液和50％(V/V)乙醇混合溶液，第二清洗液是70％‐85％(V/V)乙醇；

(5)洗脱

将洗脱液与清洗后的金磁微粒-核酸复合物混合均匀，使DNA与RNA从磁性微粒上洗脱下来，在外加磁场的作用下，将磁性微粒与洗脱下的总核酸分离，收集上清液，即为纯化得到的总核酸。

基于上述基本方案，本发明还做如下优化限定和改进：

步骤(1)中的稀释液为终浓度0.01M‐0.1MTris‐HCl、0.001M‐0.010M EDTA以及质量分数0.1％‐0.5％SSC和0.2‐0.8％SDS的混合溶液。稀释液成分可有效地螯合活化核酸酶所需的金属阳离子，由此抑制核酸酶的活性；同时，稀释液中含有离子型表面活性剂，可充分去除核蛋白及细胞中的蛋白质杂质。

步骤(2)中的结合液为无水乙醇。在与PEG-8000等多种常用结合液比较之后，无水乙醇的纯化效果最佳，不会影响磁粒与匀浆液的结合。

步骤(5)中的洗脱液为无核糖核酸酶水。

待纯化样本的质量≤10mg。