[发明专利]一种测定人体中甘胆酸含量的试剂盒及制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物化学技术领域，具体涉及一种采用免疫竞争法、胶乳增强比浊法测定人体中甘胆酸（CG）含量的试剂及其制备方法。 

背景技术

血清甘胆酸(Cholyglycine,CG)是胆酸与甘氨酸结合二次的结合型胆酸之一，在肝细胞内，胆固醇经过及其复杂的酶促反应，转变成初级胆汁酸。其中有胆酸(CA)和鹅去氧胆酸（CD-CA）。胆酸的类固醇核上有三个羟基(C3、C7、C12），侧链末端的羟基以肽键与甘氨酸结合，CG由肝细胞合成，经毛细胆管、胆管排入胆囊，随同胆汁进入十二指肠，帮助食物消化。95%胆酸在回肠末端重吸收，经门静脉再回肝脏，由肝细胞摄取再利用。在血清中主要以蛋白结合形式存在。正常情况下，外周血中胆酸含量甚微，正常成人无论空腹或餐后，其血清CG浓度稳定在低水平。当肝细胞受损时，肝细胞摄取CG能力下降，致使血中CG含量增高；胆汁郁滞时，肝脏排泄胆酸发生障碍，而返流血液循环的CG含量增高，也使血CG含量增高。测定血清甘胆酸（CG）是评价肝细胞功能及其肝胆系物质循环功能的敏感指标之一。另外孕妇在怀孕的中后期，由于婴儿的增大，会压迫肝脏，使肝脏排泄胆酸发生障碍而导致甘胆酸偏高，另外由于妊娠期胎盘合成和分泌大量雌激素和孕激素以及代谢负荷增大，可诱发肝胆系统的变化，使孕妇易患妊娠肝内胆汁淤积症(ICP)，对胎儿产生严重的影响，随ICP患者血清CG增高使羊水污染率、早产率、胎儿宫内窘迫率及剖宫产率增高，严重者可导致婴儿的死亡，因此测定孕妇血清甘胆酸，对及早发现ICP和了解ICP的严重程度有着非常重要的意义，甘胆酸的测定可作为筛查和随访ICP的指标。从而降低围产儿病死率。甘胆酸是肝脏分泌到胆汁中最大量的有机酸，进入肠腔帮助脂肪消化吸收，在回肠和结肠大部分被重吸收，经门静脉入肝脏。肝细胞能高效能地从门静脉摄取大量的甘胆酸，以致血液中的甘胆酸量小于1.9g/ml。重吸收的甘胆酸又进入肝肠循环，通过这种机制，机体能充分利用甘胆酸。一旦肝细胞病变，血中的甘胆酸浓度升高，其中急性肝炎、慢性肝炎轻度升高，肝硬变，肝癌病人显著升高。当肝细胞受损时，肝细胞摄取CG能力下降，致使血中CG含量增高；胆汁郁滞时，肝脏排泄胆酸发生障碍，而返流血液循环的CG含量增高，也使血CG含量增高。因此，测定血清甘胆酸（CG）是评价肝细胞功能及其肝胆系物质循环功能的敏感指标之一。 

目前已知的甘胆酸测定方法有放射免疫法（RIA）、化学发光法、酶联免疫吸附法（ELISA）法、胶乳增强比浊法等，放射免疫分析法步骤繁琐，试剂价格昂贵，需使用配 套的仪器且存在放射性污染。酶联免疫吸附法存在检测时间长、操作复杂、重复性差、不适于急诊和临床病人及时诊断的需要。现有胶乳增强免疫比浊法虽然操作简单、快速、但是灵敏度低，低值重复性差。 

发明内容

本发明为了避免现有技术存在的不足之处，提供一种能够应用到全自动化生化分析仪器上甘胆酸（CG）试剂盒及其制备方法。该试剂能够快速、准确的检测人血浆样本中的甘胆酸含量。 

本发明通过用偶联在蛋白上的甘胆酸包被胶乳颗粒并悬浮在特定缓冲液中制作R2试剂。由于甘胆酸分子量非常小，只有一个抗原位点，不能制成胶乳试剂，抗原与抗体的反应不能形成胶联而产生浊度，只能让甘胆酸首先通过化学键偶联在大分子蛋白上，形成多个位点，而分子量较大的蛋白可以更好的与胶乳颗粒结合，偶联有甘胆酸的蛋白浓度为0.1-2.0mg/mL。偶联有甘胆酸的蛋白进一步通过化学交联方法包被在胶乳颗粒表面。 

本发明通过在特定缓冲液中加入甘胆酸-蛋白偶联物制作R1试剂，特定缓冲液中要添加无机盐、促凝剂、蛋白质和防腐剂。所选择的甘胆酸-蛋白复合体首先要通过间接ELISA方法检测,确认不会产生非特异性反应。其中要求缓冲液的缓冲能力为调节pH范围在7-9之间，可以选择各种缓冲液，优选HEPES、甘氨酸、Tris等，与其他缓冲液相比，上述缓冲液具有缓冲能力強、溶解度高、很好的生物适应性和反应。其中Tris-HCl能较长时间控制恒定的pH范围，因此更优选Tirs-HCl，其浓度范围为10-100mM，pH范围为7-8。促凝剂选择PEG-6000，可以加快免疫反应速度，缩短检测时间，其终浓度为2-6%。蛋白质选择牛血清白蛋白，终浓度为0.1-1%。氯化钠浓度为0.7-0.9%，叠氮钠浓度为0.05-0.1%。