[发明专利]一种测定人体中甘胆酸含量的试剂盒及制备方法

权利要求书

1.一种测定人体甘胆酸含量的试剂盒，其特征在于包括：甘胆酸R1试剂；甘胆酸R2试剂和甘胆酸校准品； 

所述甘胆酸R1试剂由甘胆酸-蛋白偶联物和缓冲液组成，所述缓冲液为浓度10-100mM的Tirs-HCl溶液，所述缓冲液的pH值为7-8；所述缓冲液中含有浓度2-6wt%的PEG-6000、0.7-0.9wt%的氯化钠、0.05-0.1wt%的叠氮钠、0.3wt%的PC-300、0.1-1wt%牛血清白蛋白以及20mM EDTA；所述甘胆酸R1试剂中甘胆酸-蛋白偶联物的浓度为0.05-2mg/mL；所述甘胆酸-蛋白偶联物是通过偶联剂将甘胆酸和蛋白偶联后获得；所述甘胆酸-蛋白偶联物中蛋白浓度为0.1-2.0mg/mL； 

所述甘胆酸R2试剂由悬浮缓冲液和甘胆酸-蛋白抗体包被的胶乳颗粒组成，所述悬浮缓冲液为含有稳定剂和防腐剂的浓度为20-100mM的甘氨酸-Na0H缓冲液；所述稳定剂由终浓度0.1-1.0wt%的牛血清白蛋白、0.7-0.9wt%的氯化钠、5-50mM的乙二胺四乙酸二钠、体积浓度0.1-1.0%TX-100组成；所述防腐剂为PC-300，终体积浓度为0.05-0.1%；所述甘胆酸R2试剂中甘胆酸-蛋白抗体包被的胶乳颗粒的质量分数为0.05-1.0%； 

所述甘胆酸校准品是由人源性甘胆酸和缓冲液组成，所述缓冲液为浓度50-200mM的Tirs-HCl溶液，所述缓冲液中含有终浓度0.1-1wt%的牛血清白蛋白、0.05-0.5wt%的PC-300、5-50mM的乙二胺四乙酸二钠；所述甘胆酸校准品包括人源性甘胆酸浓度分别为0、2.5、5、10、20、40、80ug/ml的一组校准品。 

2.根据权利要求1所述的一种测定人体甘胆酸含量的试剂盒，其特征在于，与甘胆酸偶联的蛋白选自人血清白蛋白、牛血清白蛋白、牛转铁蛋白、血蓝蛋白中的一种亚型或多种亚型的混合；所述偶联剂选自碳化二亚胺、戊二醛、二异氰酸化合物或二卤化二硝基苯中的一种或多种。 

3.根据权利要求1所述的一种测定人体甘胆酸含量的试剂盒，其特征在于，所述胶乳颗粒为核壳结构，直径范围为100-450nm，浓度为1-5mg/mL；所述胶乳颗粒的表面帯有由羧基、氨基、羟基、酰肼基或氯甲基修饰的化学基团；所述甘胆酸-蛋白抗体与胶乳颗粒本身携带的化学基团通过化学键结合在胶乳颗粒表面。 

4.一种测定人体甘胆酸含量的试剂盒的制备方法，其特征在于包括如下步骤： 

一、甘胆酸-蛋白偶联物的制备： 

1）准确称取2mg甘胆酸，将其溶解在100μl DMF试剂中，所得溶液为A液；用DMF配制89.4mg/mL的NHS溶液，所的溶液为B液；用DMF配制60.2mg/mL的二环己基碳二亚胺溶 液，所得溶液为C液；称取16mg血蓝蛋白，将其溶解在1mL pH7.2、浓度0.02mol/L磷酸盐缓冲液中；所得溶液为D液； 

2）分别取B液和Ｃ液各30.7μL加到100μl A液中，室温下搅拌90min； 

3）将搅拌完毕的混合液加到D液中，在4℃条件下搅拌12h； 

4）将步骤3）处理的反应液放入pH7.4、浓度0.01mol/L磷酸盐缓冲液中透析12h，即得到甘胆酸-蛋白偶联物； 

二、甘胆酸-蛋白抗体包被的胶乳颗粒制备: 

1）以步骤一所得的甘胆酸-蛋白偶联物皮下免疫小鼠；选择免疫后血清效价大于10000的小鼠脾脏细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合，通过BSA-CG板筛选得到甘胆酸单克隆细胞抗体； 

2）把1.5g胶乳颗粒加入150mlPH5.5、浓度80mmol/L的2-吗啉代乙磺酸缓冲液中，搅拌30分钟；然后添加0.067mg/ml的碳化二亚胺20ml以及0.033mg/ml的N羟基琥珀酰亚胺20ml，常温反应45分钟； 

3）把经步骤2）反应后的混合物，以15000转/mim离心15分钟，去上清液，然后用150ml PH8.2、浓度0.1mol/L的磷酸盐缓冲液重悬；得到胶乳颗粒混悬液； 

4）将所得的胶乳颗粒混悬液重复步骤3），重复后所得到的胶乳颗粒混悬液进行清洗；清洗后，用浓度0.1mol/L的磷酸盐缓冲液把体积调整至700ml； 

5）将180mg甘胆酸单克隆细胞抗体加入到300ml PH8.2、0.1mol/L磷酸缓冲液中，搅拌均匀；加入到步骤4）的胶乳溶液中；然后置于37度的摇床中，反应2-4个小时；再加入0.5g/ml甘氨酸10ml，再次反应30分钟； 

6）步骤5）反应结束后，将5g牛血清白蛋白加到上述混合液中，搅拌均匀后，室温放置12h；然后9000转/mim离心15分钟，去上清液，用500ml PH8.2、浓度0.1mol/L的磷酸盐缓冲液重悬；得胶乳颗粒混悬液； 

7）将所得到的胶乳颗粒混悬液再经9000转/mim离心15分钟，去上清液，用500ml PH8.2、浓度0.1mol/L的磷酸盐缓冲液重悬；将再次重悬后所得的胶乳颗粒混悬液用PH8.2、浓度0.1mol/L的磷酸盐缓冲液把体积调整至1000ml；所得溶液即为甘胆酸-蛋白抗体包被的胶乳颗粒； 

三、甘胆酸R1试剂的制备 

将步骤一制备获得的甘胆酸-蛋白偶联物与缓冲液充分混合即得甘胆酸R1试剂，所述缓冲液为浓度10-100mM的Tirs-HCl溶液，所述缓冲液的pH值为7-8；所述缓冲液中含有浓 度2-6wt%的PEG-6000、0.7-0.9wt%的氯化钠、0.05-0.1wt%的叠氮钠、0.3wt%的PC-300、0.1-1wt%牛血清白蛋白以及20mM EDTA；所述甘胆酸R1试剂中甘胆酸-蛋白偶联物的浓度为0.05-2mg/mL； 

四、甘胆酸R2试剂的制备 

将步骤二制备获得的甘胆酸-蛋白抗体包被的胶乳颗粒与悬浮缓冲液混合即得甘胆酸R2试剂，所述悬浮缓冲液为含有稳定剂和防腐剂的浓度为20-100mM的甘氨酸-Na0H缓冲液；所述稳定剂由终浓度0.1-1.0wt%的牛血清白蛋白、0.7-0.9wt%的氯化钠、5-50mM的乙二胺四乙酸二钠、体积浓度0.1-1.0%TX-100组成；所述防腐剂为PC-300，终体积浓度为0.05-0.1%；所述甘胆酸R2试剂中甘胆酸-蛋白抗体包被的胶乳颗粒的质量浓度为0.05-1.0%。 

五、甘胆酸校准品的制备 

向缓冲液中加入不同量的人源性甘胆酸得到浓度分别为0、2.5、5、10、20、40、80ug/ml的一组校准品；所述缓冲液为浓度0-200mM的Tirs-HCl溶液，所述缓冲液中含有终浓度0.1-1wt%的牛血清白蛋白、0.05-0.5wt%的PC-300、5-50mM的乙二胺四乙酸二钠。