[发明专利]罗非鱼sIgM截短重链恒定区蛋白多克隆抗体及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体来说是一种通过原核表达来生产罗非鱼sIgM截短重链恒定区蛋白多克隆抗体及其该抗体的制备方法。

背景技术

罗非鱼（Tilapia）是一种淡水鱼类，属于丽鱼科（Cichlidae），是非洲和中东特有的鱼种，具有杂食性、生长快、繁殖力强、适应性广等优点，现已经成为21世纪全球水产养殖业最重要的养殖品种之一。中国的罗非鱼养殖产量占世界的一半以上，每年罗非鱼出口额超过7亿美元，出口量超过20多万吨（折合活鱼60多万吨）。罗非鱼具有极强的抗病能力，曾被认为对细菌性、寄生虫性、真菌性和病毒性疾病都具有比其它鱼类更强的抵抗力。然而近年来，研究发现罗非鱼对某些细菌和寄生虫病原都表现敏感，如链球菌、柱状黄杆菌、嗜水气单胞菌、爱德华氏菌、小瓜虫、车轮虫、三代虫等。

免疫球蛋白是免疫系统中重要的组成成分，是病原诊断和疫苗评价的重要指标。罗非鱼IgM具有分泌型（Secretory form of IgM，sIgM）和膜结合型（Membrance-bound，mIgM）两种形式，其重链（IgH）由相同基因编码但编码的恒定区不完全相同。分泌型IgM具有4个恒定区，而膜结合型IgM则由3个恒定区和一个位于CH3下游的跨膜组成。sIgM由浆细胞产生分泌于血液和体液中，是机体进行体液免疫中的重要组成部分，在研究鱼类病害防治及免疫预防方面具有重要意义。目前，国内外关于抗罗非鱼IgM抗体甚少，虽然国外已有鼠抗罗非鱼IgM的单克隆抗体，但价格十分昂贵且保质期短。此外，自制单克隆抗体不仅技术要求高、实验仪器高而且成本昂贵；而直接从罗非鱼血清中提取IgM，不仅难以保证纯度，而且需要大量的血液，违背了动物福利。

发明内容

本发明的目的是提供一种原核表达罗非鱼sIgM截短重链恒定区蛋白（dsIgM）的方法，采用该方法制备的dsIgM产量高、成本低、操作简单、免疫原性好。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

1、一种罗非鱼sIgM截短重链恒定区蛋白多克隆抗体，该蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2、一种罗非鱼sIgM截短重链恒定区蛋白的编码基因，该编码基因序列如SEQ ID NO.2所示。

3、一种含有编码基因的重组表达载体。

4、一种含有权利要求3中所述的重组表达载体的工程菌。

5、罗非鱼sIgM截短重链恒定区蛋白多克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：

（1）将该截短重链恒定区基因（dsIgM）与pET32a构建为表达载体pET32a-dsIgM；

（2）将pET32a-dsIgM表达载体转化入大肠杆菌BL21(DE3),构建表达工程菌；

（3）发酵培养表达工程菌，进行IPTG诱导表达；

（4）发酵产物经亲和层析得到纯化的截短重链恒定区蛋白（dsIgM）；

（5）该dsIgM免疫新西兰兔，收集血清，用饱和硫酸铵法纯化兔抗dsIgM抗体；

（6）该兔抗dsIgM抗体作为Western-Blot一抗结合鲤鱼、鲫鱼、斑点叉尾鮰、罗非鱼血清，测定其特异性；

（7）该兔抗dsIgM抗体用于非竞争ELISA，检测其亲和常数。

进一步的，所述步骤（1）包括：以罗非鱼血液为材料提取总RNA，以mRNA为模版合成第一条cDNA；

设计两条引物：

P1：5′-GGATCCGCCACTTCAACTGC-3′

P2：5′-CTCGAGGTCTTGGTTGATGTTC-3′

其中下划线为BamHⅠ和xholⅠ酶切位点，以该cDNA为模版，通过PCR扩增得到编码sIgM的截短重链恒定区蛋白（dsIgM）的DNA片段，测序确认后，通过双酶切与质粒pET32a连接，构建表达载体pET32a-dsIgM。

进一步的，所述步骤（3）包括：采用LB培养基，37℃发酵培养表达工程菌至OD₆₀₀达到0.6，加入终浓度为1mmol/L的IPTG，37℃诱导表达4h。

进一步的，所述步骤（6）包括：采集鲤鱼、鲫鱼、斑点叉尾鮰、罗非鱼血液进行SDS-PAGE，运用Western-Blot检测兔抗dsIgM抗体的特异性。