[发明专利]罗非鱼sIgM截短重链恒定区蛋白多克隆抗体及其制备方法

权利要求书

1.一种罗非鱼sIgM截短重链恒定区蛋白多克隆抗体，其特征在于，该蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种罗非鱼sIgM截短重链恒定区蛋白的编码基因，其特征在于，该编码基因序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一种含有编码基因的重组表达载体。

4.一种含有权利要求3中所述的重组表达载体的工程菌。

5.罗非鱼sIgM截短重链恒定区蛋白多克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）将该截短重链恒定区基因与pET32a构建为表达载体pET32a-dsIgM；

（2）将pET32a-dsIgM表达载体转化入大肠杆菌BL21，构建表达工程菌；

（3）发酵培养表达工程菌，进行IPTG诱导表达；

（4）发酵产物经亲和层析得到纯化的截短重链恒定区蛋白；

（5）该dsIgM免疫新西兰兔，收集血清，用饱和硫酸铵法纯化兔抗dsIgM抗体；

（6）该兔抗dsIgM抗体作为Western-Blot一抗结合鲤鱼、鲫鱼、斑点叉尾鮰、罗非鱼血清，测定其特异性；

（7）该兔抗dsIgM抗体用于非竞争ELISA，检测其亲和常数。

6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）包括：以罗非鱼血液为材料提取总RNA，以mRNA为模版合成第一条cDNA；

设计两条引物：

P1：5′-GGATCCGCCACTTCAACTGC-3′

P2：5′-CTCGAGGTCTTGGTTGATGTTC-3′

其中下划线为BamHⅠ和xholⅠ酶切位点，以该cDNA为模版，通过PCR扩增得到编码sIgM的截短重链恒定区蛋白的DNA片段，测序确认后，通过双酶切与质粒pET32a连接，构建表达载体pET32a-dsIgM。

7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）包括：采用LB培养基，37℃发酵培养表达工程菌至OD₆₀₀达到0.6，加入终浓度为1mmol/L的IPTG，37℃诱导表达4h。

8.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（6）包括：采集鲤鱼、鲫鱼、斑点叉尾鮰、罗非鱼血液进行SDS-PAGE，运用Western-Blot检测兔抗dsIgM抗体的特异性。

9.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（7）包括：用纯化罗非鱼血清作为抗原，按50μg/ml、25μg/ml、12.5μg/ml、6.25μg/ml、3.12μg/ml、1.56μg/ml和0.78μg/ml包被ELISA板，将步骤（5）中的兔抗dsIgM抗体按1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600、1:3200、1:6400、1:12800、1:25600、1:51200、1:102400、1:204800的比例倍比稀释作为一抗，羊抗兔IgG-HRP作为二抗，进行亲和常数测定。