[发明专利]一种基于酶切作用的胰蛋白酶和糜蛋白酶电化学同时检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于酶切作用的电化学检测方法及其在胰蛋白酶和糜蛋白酶同时检测中的应用，属于电化学传感技术领域。 

背景技术

蛋白酶是生物体内的一类能够分解蛋白质的酶，蛋白酶功能紊乱将会导致包括癌症、病毒感染、神经退行性疾病等在内的疾病发生，使得蛋白酶成为临床研究热点。热量学、电化学方法、荧光、电感耦合等离子体-质谱、表面拉曼散射以及电泳等方法被广泛用于蛋白酶的生物实验。然而，这些方法大多用于单个蛋白酶的检测，难以对生物样品中多种蛋白酶进行同时测定。研究表明，蛋白酶很少单独发生作用，而是在一个称作“蛋白酶网络”的系统中发挥作用。因此，发展蛋白酶的快速和同时检测方法具有重要意义。 

电化学生物传感由于灵敏度高、简单、快速、仪器小型化等特点，被广泛用于检测蛋白质、DNA和生物小分子等物质。为了提高检测灵敏度，纳米材料被引入生物传感器件的构建中，在众多的纳米材料中，金纳米粒子具有大比表面积、高表面能、良好的传导性和生物相容性，在生物传感器中作为生物分子和电子介体的载体以及电子传导体等得到了广泛应用。 

发明内容

本发明的目的在于提供了一种基于酶切作用的电化学检测方法及其在胰蛋白酶和糜蛋白酶同时检测中的应用。 

本发明是这样来实现的，先将DNA1-多肽1和DNA2-多肽2通过半胱氨酸的巯基以Au-S键方式固定到金电极表面，再将两种相应的纳米信号探针DNA1′-AuNPs-硫堇和DNA2′-AuNPs-二茂铁通过DNA杂交反应组装到电极上。当胰蛋白酶和糜蛋白酶共存时，胰蛋白酶剪切多肽1的精氨酸羧基位点，糜蛋白酶剪切多肽2的酪氨酸羧基位点，使得部分DNA1′-AuNPs-硫堇和DNA2′-AuNPs-二茂铁纳米信号探针脱离电极表面，导致硫堇和二茂铁的峰电流下降。此外，由于两种蛋白酶对多肽剪切位点具有良好的特异性，而且电子介体硫堇和二茂铁的峰电位差异较大，因此，可成功用于胰蛋白酶和糜蛋白酶的高灵敏和选择性同时检测。 

  

本发明采用以下技术方案：

（1）金纳米粒子的制备：50 mL的0.01% HAuCl₄溶液在不断搅拌的情况下加热至沸腾，然后加入1 mL质量浓度为5%的柠檬酸三钠，继续搅拌并保持沸腾状态，直至溶液颜色由黄色变成深红色，继续保持沸腾10分钟，自然冷却至室温，将制备的金纳米粒子放在4°C冰箱中保存；

（2）DNA-多肽复合物的制备：将200 μL 25 μM多肽、200 μL 5 μM的DNA和1mg/mL链霉亲和素混合均匀，室温下反应3小时，未反应的DNA和多肽经6000转/分钟的转速超滤5分钟除去，得到DNA-多肽复合物，于4 °C保存；

（3）电化学纳米信号探针的制备：将0.3 mL 25 μM的巯基DNA与4.7 mL 12 nM的金胶混合反应24小时，制备的DNA-AuNPs复合物用1 M的NaCl稳定；将0.2 mL 0.1 mM的电子介体加入0.2 mL的DNA-AuNPs溶液中，在25 oC持续搅拌反应24小时，加入1 mL质量浓度1%的BSA，反应1小时。所得溶液在16000转/分钟下离心10分钟，去除上层清液，将产物重悬于浓度为10 mM、pH 7.7的磷酸盐缓冲溶液中，制成DNA1′-AuNPs-硫堇和DNA2′-AuNPs-二茂铁纳米信号探针。

（4）基于酶切作用的胰蛋白酶和糜蛋白酶电化学传感器构建：将金电极浸入DNA1-多肽1和DNA2-多肽2的混合溶液中孵育12小时，用1 mM的巯基己醇封闭1小时，再浸入含有DNA1′-AuNPs-硫堇和DNA2′-AuNPs-二茂铁纳米信号探针的溶液中，通过DNA杂交反应将两种纳米信号探针固定到电极表面。 

基于酶切作用的胰蛋白酶和糜蛋白酶电化学同时检测应用：将制备的电化学传感器浸入含有胰蛋白酶和糜蛋白酶的溶液中反应25分钟，胰蛋白酶剪切多肽1上的精氨酸羧基位点，糜蛋白酶剪切多肽2上的酪氨酸羧基位点，使得连接于多肽上的相应的纳米信号探针脱离电极表面，导致相应的电子介体硫堇和二茂铁的峰电流下降。随着蛋白酶浓度的增大，硫堇和二茂铁的峰电流减小，峰电流减小的程度与胰蛋白酶和糜蛋白酶在0.006-0.18 μg/mL和0.0055-0.25 μg/mL范围内呈良好的线性关系，检测限分别为2.5 ng/mL和1.6 ng/mL，表明本发明建立传感方法可用于对多种蛋白酶的高灵敏和特异性同时检测。