[发明专利]检测猪唾液中伪狂犬病毒gB蛋白特异性抗体的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种检测猪唾液中伪狂犬病毒gB蛋白特异性抗体的方法。

背景技术

伪狂犬病（Pseudorabies）是目前危害我国养猪业最重要的疾病，在世界上的大部分地区呈地方性流行。伪狂犬病由伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV）引起，也称奥耶斯基氏病（Aujeszky's disease），发生于牛而称“疯痒病”（mad itch）。伪狂犬病病毒潜伏在受感染猪的唾液和鼻腔分泌物中并主要通过口鼻传播。感染伪狂犬病的猪通常不会表现出症状，但伪狂犬病病毒会导致流产、仔猪的高死亡率以及仔猪和成年猪的咳嗽、喷嚏、高烧、便秘、精神不振、抽搐、转圈和流涎过度。低于1月龄的仔猪死亡率接近100%，而1-6月龄的猪死亡率低于10%。怀孕母猪可能会吸收胎儿、分娩出木乃伊胎、死胎和弱小仔猪。

目前，已有成熟的gE基因缺失伪狂犬病毒疫苗，广泛用于临床免疫，是目前控制该病最主要的手段。一方面，兽医可以通过检测伪狂犬病毒gB蛋白特异性抗体，以检测疫苗的免疫效果；另一方面，对gE蛋白特异性抗体的监测，可以很好的监控猪群中伪狂犬病毒野毒德感染情况。

采集免疫后猪只血液样本，分离血清，并检测伪狂犬病毒gB蛋白特异性的血清抗体，是目前监控伪狂犬疫苗免疫效果效果的最主要手段，对免疫程序制定、流行状态监测均具有重要意义。然而这种采样方式存在诸多限制，一方面这种采集血液、分离血清的方法费时费力，采集的样本数量不大，占猪群的比例不高，且对动物的应激非常大。固定一头体重在50公斤左右的生长猪，并从前腔静脉采集血液，通常需要2-3个人，平均花费10分钟左右。而本专利设计的唾液样本采集方法，则以同一栏的猪为单位采集（15-20头），只需一个人，平均花费5分钟，悬挂和收集唾液采集绳，即可。相对而言，唾液采集法获得的样本可覆盖整群动物，数据基本可代表整群动物的平均免疫情况，更能反映猪群抗体的总体水平。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种检测猪唾液中伪狂犬病毒gB蛋白特异性抗体的方法。

检测猪唾液中伪狂犬病毒gB蛋白特异性抗体的方法包括如下步骤：

1）利用悬挂棉绳法，诱导动物咀嚼，采集唾液，处理后获得唾液一抗；

2）将唾液一抗，以PBST溶液1:2稀释后，按编号加入伪狂犬病毒gB抗原包被的96孔聚苯乙烯反应板的反应孔中，每个反应孔加150ul，37℃饱和湿度反应1小时, 以PBST洗涤3次；

3）将辣根过氧化物酶标记的羊抗猪IgG-FC抗体，以 PBST溶液1:1500稀释后，按顺序加入到96孔聚苯乙烯反应板的反应孔中，每个反应孔加100ul，37℃饱和湿度避光反应30分钟，以PBST洗涤3次；

4）将5%的二甲氧联苯胺显色剂，按顺序加入到96孔聚苯乙烯反应板的反应孔中，每个反应孔加50ul，避光反应15分钟，随后每个反应孔加入50ul 2M浓硫酸；

5）放入酶标仪中，读取OD405数据，判定结果。

所述的步骤1）为：以6股、直径3mm、长1m的全棉绳索悬挂于猪群中间或围栏上，底端高度与动物肩部齐平，并将绳索的悬挂端解松，待猪群撕咬30min后，回收绳索，并置于无菌的样品收集袋中，用双手放在样品袋外挤出浸润在绳索上的唾液，并收集与无菌的50ml离心管中，以3000g离心15min，取上清，获得唾液一抗，保存备用。

所述的步骤5）为：将终止后的96孔聚苯乙烯反应板，放入预热的酶标仪中，读取各反应孔的OD405数值，并根据以下公式判定结果：S/P值=(样品OD-阴性对照OD)/(阳性对照OD-阴性对照OD)。S/P值≥0.2，判为阳性，对应群体阳性率≥80%；S/P值＜0.2，判为阳性，对应群体阳性率＜80%。

本发明提供的伪狂犬病毒唾液抗体采集和检测方法，避免了对单个动物采血的问题，相对于传统的血清抗体采集和检测方法，具有以下优点：1）唾液抗体的棉绳采集法对猪群没有任何应激，2）节省采样时间达 80%以上，3）节省2/3的采样人员，4）唾液样品对温度、环境、污染物的抵抗力更强，运输和保存更方便，4）可以对整个猪群实行大面积采样，所得结果更客观全面，5）伪狂犬病毒gB蛋白病毒唾液抗体检测与血清抗体检测的符合率在100%。

附图说明

图1是检测猪唾液中伪狂犬病毒gB特异性抗体的方法的过程示意图；

图2是本发明的利用悬挂棉绳法，诱导动物咀嚼，采集唾液，处理后获得唾液一抗的示意图。