[发明专利]检测蛋白质稳定性的方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及蛋白质检测领域。具体地说，本发明涉及检测蛋白质稳定性的方法及其应用。 

背景技术

蛋白质水平的动态变化是细胞保持活力和进行生命活动的基本特征和必要前提。在任何时间点，细胞内特定蛋白质的水平取决于其合成与降解过程之间的动态平衡。蛋白质的合成主要在核糖体上进行，目前对蛋白质合成的及其调节的过程都了解得相对清楚。 

人类对蛋白质降解过程的研究始于上世纪八十年代，近年来已经发展成为现代生物学的一个非常重要的研究领域。这是因为所有的蛋白都必须被适时的降解，细胞的基本生命过程例如细胞周期的进行才得以成为可能。无数证据表明，许多受到损伤的或者折叠错误的蛋白也都必须降解掉，否则正常的细胞功能就会受到影响，从而导致如癌症、神经退行性疾病等(C.Raiborg和H.Stenmark,2009;Christian Hirsch等,2009;Steven Bergink和Stefan Jentsch,2009)。 

因为很多疾病的病理过程都与蛋白质降解途径的不正常有关(Salvatore Oddo,2008;Jeffrey H Kordower,2008;Jianjun Wang,2008)，许多肿瘤细胞与病毒也是利用泛素蛋白酶体系统扰乱蛋白质的降解，从而达到肿瘤细胞的扩散或对宿主细胞的入侵(Daniela Hoeller和Ivan Dikic,2009)。目前许多影响蛋白质降解途径的药物已经或正在开发之中。已有的研究结果和临床试验的数据都显示这类药物对很多目前难以治愈的疾病都具有极高的潜在药用价值(Matthew D Petroski,2008;Grzegorz Nalepa,2006)。 

因此，研究蛋白质稳定性的差异变化对于相应蛋白质受累疾病的预测、及发病、病因、治疗药物的筛选等均存在重要的提示作用，检测蛋白质稳定性的异常变化对于研究发病机制尤为重要。现在主要的方法是通过Cycloheximide时间梯度实验来检测蛋白质的稳定性。然而，这一方法不仅工作量大，而且对于研究蛋白质组学范围内的蛋白质差异变化无能为力。同时，该方法因实验的复 杂性而不适用于高通量药物筛选。 

蛋白质芯片技术可以一次性检测多种蛋白质的稳定性，但由于抗体的可用性，使得其通量有限，同时也极大的限制了该技术的实用性。利用质谱技术可以实现大规模样品，蛋白质组学范围内的蛋白质稳定性变化的检测，但是质谱技术识别能力有限，对于低丰度蛋白稳定性的变化无法检测。 

在细胞生物学与分子生物学领域中，荧光蛋白分子具有广泛的应用。荧光蛋白常常会被用做报告基因，标识目标蛋白的细胞定位，同时可以结合FACS技术，进行目标蛋白分子胞内丰度的相对定量。 

因此，本领域急需能够实现广泛应用于全基因组范围内蛋白质稳定性的检测，并且易于应用于高通量小化合物筛选的新型检测方法。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种可用于检测蛋白质稳定性的融合蛋白以及编码所述融合蛋白的遗传构建物、包含所述遗传构建物的载体、包含所述遗传构建物或载体的细胞，以及由所述细胞构成的文库和检测蛋白质稳定性的方法和应用。本发明方法对蛋白质稳定性的检测不仅灵敏度和特异性高，而且操作简便。 

在第一方面，本发明提供一种遗传构建物，其结构如下式所示： 

5’-A+B+C+D+E-3’， 

其中， 

A表示启动子； 

B表示由目标蛋白和第一标记蛋白构成的融合蛋白的编码序列； 

C表示连接肽的编码序列； 

D表示第二标记蛋白的编码序列；和 

E表示终止子； 

其中，B和D可以互换。 

在优选的实施方式中，所述启动子为CMV启动子。 

在另一优选的实施方式中，B中5’-3’依次包含目标蛋白的编码序列和第一标记蛋白的编码序列。 

在另一优选的实施方式中，所述连接肽选自：泛素、泛素截短体、泛素突变体及类泛素、2A短肽等；优选泛素；最优选K(R)饱和突变的泛素。 

在优选的实施方式中，所述第一标记蛋白和第二标记蛋白是荧光蛋白。 

在优选的实施方式中，所述荧光蛋白选自EGFP或RFP；优选第一标记蛋白是EGFP，第二标记蛋白是RFP。 

在优选的实施方式中，所述EGFP是mEGFP，所述RFP是mRFP。 

在优选的实施方式中，所述荧光蛋白C端或N端融合有一个或多个标签蛋白，例如Flag或myc。