[发明专利]一种抗CD20单链抗体的植物种子表达系统

说明书

技术领域

本发明属基因工程技术领域，具体涉及抗CD20单链抗体基因及利用植物种子特异性表达启动子在植物种子中高效表达抗CD20单链抗体的方法。

背景技术

    根据《2012中国肿瘤登记年报》显示，目前我国每年新发癌症病例约312万，因癌症死亡超过200万。恶性肿瘤已经成为我们城乡居民的第一位死亡原因。非霍奇金氏淋巴瘤（Non Hodgkin’s lymphoma, NHL）是最常见的淋巴系统恶性肿瘤，其中绝大多数为B细胞淋巴瘤。CD20抗原是一种B细胞分化抗原，位于B细胞的表面，仅存在于成熟B细胞和B细胞前体中，在正常组织中不表达，而在95%以上的B细胞淋巴瘤中均有过量表达。这也使CD20成为了治疗B细胞淋巴瘤的一个理想靶点。Rituxan（Rituximab，美罗华）为美国罗氏公司产品，是一种人鼠嵌合抗体。Rituxan于1997年获得FDA批准上市，是第一个被批准用于治疗恶性肿瘤的单克隆抗体。目前用于治疗低恶度、滤泡型B细胞淋巴瘤。

随着对Rituxan治疗其他一些自身免疫性疾病研究的深入，Rituxan在临床疾病治疗方面的潜在价值将会被进一步开发，社会对其的需求也越来越大。但是由哺乳动物细胞（CHO）生产的Rituxan需要昂贵的设备和培养基，从而增加了其生产成本，导致其价格高昂（一疗程的费用约20万元人民币左右）。

利用植物反应器已经成功的表达了多种具有生物活性和功能的药用蛋白，其中包括单克隆抗体、疫苗抗原、治疗用酶、血液蛋白、细胞因子、生长因子和生长激素等。而以植物作为生物反应器则具有诸多的特点和优点：（1）可根据重组蛋白的需求来选择不同形式的表达体系，可分为整株表达和组织特异性表达，如种子、须根，以及悬浮细胞等；（2）大规模生产时具有较低的生产成本和灵活性；（3）植物具有与哺乳动物细胞相似的蛋白翻译后修饰途径，从而获得有功能的活性蛋白；（4）较高的安全性，不携带动物病原体；（5）便于储藏和运输。

尽管豆类和谷类等种子植物相对于叶类作物产生较少的生物量，但却为储存提供了极佳的条件。叶类作物在采样后，叶片需要冰冻或干燥以备运输，或立即进行处理；而成熟的种子却可以在室温下长时间存储。在长期的进化过程中，种子作为植物的贮藏器官，可以在很小的空间内积累大量的蛋白质，且种子中含有丰富的分子伴侣、适宜蛋白质折叠的环境以及较少的蛋白激酶。此外，大多数的种子体积较小，这样可以使表达的重组蛋白高度集中，虽然总生物产量并没有叶片植物高，但却有利于蛋白质的下游提取和纯化；而且植物种子表达重组蛋白，不会影响植物的生长。而通过将重组蛋白定向表达至液泡中存储，不仅可以获得完整的翻译后修饰，还可以提高重组蛋白的表达量。

发明内容

本发明的目的是提供一种融合基因，抗CD20单链抗体基因，以及利用植物种子表达系统表达抗CD20单链抗体基因，生产抗CD20单链抗体。

抗CD20单链抗体基因，它包括：轻链可变区-重链可变区-连接肽-人免疫球蛋白G的Fc片段并且在其5’端加入了编码大麦α-Amylase的信号肽序列；

所述的抗CD20单链抗体基因，其碱基序列如SEQ ID NO.1所示；

一种植物表达载体质粒，它是在植物表达载体中插入了上述的抗CD20单链抗体基因；

所述的植物表达载体为植物种子特异表达载体p1301b；

所述的植物种子特异表达载体p1301b，是由下述方法构建的：人工合成了β-phaseolin的启动子和终止子序列，并在启动子两端分别添加Xho I和Nco I酶切位点，在终止子两端分别添加Hind III和Kpn I酶切位点；并通过KpnI和Bst EII双酶切的方法从pBASTA质粒上获得35S+Bar基因；同时利用Kpn I和Bst EII双酶切pCambia1301，连入35S+Bar原件，构建中间载体p1301Bas。再通过酶切，连接反应将β-phaseolin的启动子和终止子原件连接至p1301Bas中；

抗CD20单链抗体，它是由下述方法生产的：

1、将上述的一种植物表达载体质粒，转化至根瘤农杆菌EHA105中；

2、再将根瘤农杆菌转染至植物中；

3、培育所述的植物，采集种子；提取抗CD20单链抗体蛋白；

所述的植物为拟南芥、红花、玉米或亚麻芥。

上述的抗CD20单链抗体在制备治疗非霍奇金氏淋巴瘤及自身免疫性疾病药物中的应用。