[发明专利]一种用于N-糖蛋白去糖基化的糖苷酶及其应用

说明书

本发明属于糖生物学研究领域，具体涉及一种新型N‑糖苷酶，该新型N‑糖苷酶命名为二型PNGase F，PNGaseF‑II。本发明的N‑糖苷酶能够将不同糖链结构类型（高甘露糖型糖链、复合型糖链、杂合型糖链）的N‑糖蛋白上的糖链完整切除，并且它能够切除α‑1,3‑核心岩藻糖化的N‑糖蛋白的糖链，而已有的N‑糖苷酶F（PNGase F）对α‑1,3‑核心岩藻糖化的N‑糖蛋白没有酶切活性。本发明的酶对N‑糖蛋白有较为广泛的底物和有较高的实际应用价值。本发明的新型N‑糖苷酶还可以用于N‑糖链结构分析、糖链的功能分析，为糖生物学以及生物医药的研究提供一种新的工具酶。

技术领域

本发明属于糖生物学领域，涉及病原生物学、分子生物学、生物化学，具体涉及新型糖苷酶、其应用和使用方法。

背景技术

1.糖基化

糖基化是蛋白质翻译后修饰中最主要的修饰之一，在蛋白质翻译调控、蛋白质降解等过程中起着非常重要的作用(1)。50％以上的蛋白质以糖蛋白的形式存在，并且越来越多的研究表明，糖基化异常可导致人类疾病(2)。在临床治疗过程中，使用的抗体药物均带有糖基化(3)。

根据蛋白质与糖链连接方式的不同，糖基化可以大致分为四种类型：N-连接糖基化、O-连接糖基化、C-甘露糖糖基化和糖基磷脂酰肌醇(glycophosphatidly inositol,GPI)锚定连接。O-连接糖基化是指寡糖链与Ser、Thr、羟基赖氨酸或羟脯氨酸的羟基相连(4)，例如如人血纤维蛋白溶酶原、人免疫球蛋白IgA等。C-甘露糖糖基化是指甘露糖基通过C-C键连接到色氨酸吲哚环2号位C上(5)，例如胶原。糖基磷脂酰肌醇锚定连接，GPI锚的一般结构主要是由乙醇胺、糖核心和肌醇连接而成，肌醇最终通过磷酸基团与细胞膜中的磷脂结构相连，乙醇胺则与蛋白质的羧基端相连，糖没有直接和蛋白质连接而是通过乙醇胺磷酸盐桥接于核心聚糖(6)，例如细胞表面受体、膜蛋白。N-连接糖基化是寡糖链(GlcNAC的β-羟基)与Asn的酰胺基氨基形成N-连接糖蛋白(5)，例如人免疫球蛋白、转铁蛋白等。本章重点阐述N-连接糖基化。

N-连接糖基化是研究最多的一种蛋白质的糖基化形式，Asn-X-Ser/Thr结构的(X-脯氨酸外的任意一种氨基酸)Asn酰胺基氨基与寡糖链(GlcNAC的β-羟基)N-连接糖蛋白。在动物细胞中，与天冬酰胺连接的糖，几乎都是N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)，而且连接方式总是β构型(7)。N-连接糖有共同的特点是有五糖核心(2个N-乙酰葡糖胺和3个甘露糖)。与DNA和蛋白质相比，糖蛋白糖链的结构更加多样，根据它们的外层链(outer chain)结构的不同，可分为：高甘露糖型(high mannose)、杂合型(hybrid type)与复合型(complex type)。三者的区别在于，高甘露糖型只含有多个α-连接的甘露糖残基，而复杂型含有以岩藻糖(Fuc)、半乳糖(Gal)和唾液糖(SA)为组分的糖链残基，杂合型则兼有两种特点。在复杂型和杂合型糖链中，根据核心岩藻糖连接方式不同，还分为α-1,3连接核心岩藻糖和α-1,6连接核心岩藻糖，结构如图8所示。

2.去糖基化酶

近年来，糖生物学的研究日益受到生物学家的关注，蛋白质的糖基化修饰和糖蛋白的去糖基化是研究糖蛋白中糖链结构和功能的重要手段。目前阶段去糖基化的手段主要有酶法、化学法，其中酶法被认为是比较理想的方法，该法能保持蛋白质的完整性，并且适宜于许多糖蛋白。根据切除糖链位点，去糖基化酶分为三类：外切型糖苷酶、内切型糖苷酶和N-糖苷酶(N-糖酰胺酶)。

外切型糖苷酶(Exo-glycosidase)是研究最早的一类糖生物学研究的工具酶，能从糖链的外端切除糖链释放单个糖，如流感病毒表面的神经氨酸酶(NA)、α-甘露糖苷酶、β-甘露糖苷酶、β-木糖苷酶等。

内切型糖苷酶(Endo-glycosidase)都是从糖链内部专一性切开某个键，因此在糖链结构分析以及结构与功能关系研究中非常有用，也是目前糖基化工程中的重要酶，例如常用的Endo F、Endo H。