[发明专利]测定柴胡皂苷a含量的时间分辨荧光免疫分析法及试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于含量测定的化学方法技术领域，具体涉及一种测定柴胡皂苷a(SSa)含量的时间分辨荧光免疫分析法及试剂盒。

背景技术

柴胡为常用中药，其来源为伞形科植物柴胡(习称“北柴胡”)Bupleurum chinense DC.或狭叶柴胡(习称“南柴胡”)B.scorzonerifolium Willd.的干燥根。其主要成分为柴胡皂苷、挥发油。柴胡皂苷为三萜皂苷类中药成分，许多研究表明柴胡皂苷具有抗炎、抗病毒、抗肿瘤、调节内分泌及免疫系统等作用。其中柴胡皂苷a、d含量最高，在2010年版《中国药典》中已经纳入柴胡质量标准含量测定项。

柴胡皂苷的测定方法有很多，传统方法中大致有利用物理性质如泡沫指数法和皂苷指数法；化学测定法包括比色法、薄层色谱扫描法以及生物测定法-溶血指数法。此外还有分离比色法。现在许多新的技术也相继普遍应用于含量测定，如：HPLC法、高效毛细管电泳法等。且已不局限于某一种技术的单独使用，而是两种或多种技术的配合使用。近些年，也有利用单克隆抗体技术制备出抗柴胡皂苷a单克隆抗体，建立测定ssa的含量酶联免疫吸附法。

相比较于酶联免疫吸附法的酶标记物不稳定性，荧光衰变周期短。TRFIA法用稀土元素离子Eu³⁺作为示踪物，以其荧光寿命长，激发谱带宽而发射光谱很窄等特点排除非特异性荧光的干扰，具有较高的灵敏度和准确性。我国有丰富的稀土元素资源，本方法稳定性好的同时又合理利用了稀土元素资源。

发明内容

本发明克服现有技术的样品预处理繁、进行大样本测量分析时耗时长、需要使用大量有毒、昂贵的有机试剂、操作复杂、检测范围窄等上述缺陷，提出了一种测定柴胡皂苷a(SSa)含量的时间分辨荧光免疫分析法，采用时间分辨荧光免疫分析技术，建立柴胡皂苷a的定量分析方法。本发明方法具有操作简便、时间短、灵敏度高、稳定性好等优点，尤其有利于大样本或低浓度样品的检测。

本发明提出了一种测定柴胡皂苷a(SSa)含量的时间分辨荧光免疫分析法，以兔抗鼠IgG包被96孔酶标反应板，与样品中的柴胡皂苷a(SSa)竞争结合一定量的抗柴胡皂苷a的单抗；用稀土离子Eu³⁺标记SSa-HSA复合物作为示踪物；发光增强系统采用以β-二酮体为主的增强液；采用间接竞争时间分辨荧光免疫分析法，从而测定样品中的柴胡皂苷a含量。其中，所述样品包括待测样品或标准品。

本发明测定柴胡皂苷a(SSa)含量的时间分辨荧光免疫分析法，包括如下步骤：

(1)以4ug/ml兔抗鼠IgG100ul/孔包被96孔酶标板，4℃反应过夜；

(2)常温振荡1h，洗涤液清洗3次后，280ul/孔封闭液常温封闭1h，清洗4次，拍干；

(3)取柴胡皂苷a标准对照品(中国药品生物制品检定所)，配制成溶剂为10％甲醇水的标准品，每孔加入25ul标准品，浓度分别为0ng/ml、10ng/ml、50ng/ml、250ng/ml，2000ng/ml、5000ng/ml、，每个浓度3孔。再加入以稀释缓冲液1∶4000倍稀释的抗柴胡皂苷a皂苷单克隆抗体溶液和1∶800倍稀释的标记抗原复合物，贴封膜，于常温下振荡反应1h；

(4)反应结束后，清洗6次，拍干，加入增强液(由南方医科大学抗体技术研究中心提供；成分：冰醋酸、邻苯二甲酸氢钾、Triton X-100、TOPO、β-NTA、纯化水)200ul，振荡5min后，用荧光免疫分析仪Victor1420测定其荧光信号。

(5)根据荧光值，建立标准曲线。

以柴胡皂苷a的标准品建立TRFIA的标准曲线。

以上步骤(3)中以同样方法配制待测样品，经检测，在步骤(5)中测得待测样品中的柴胡皂苷a含量。

SSa-HSA复合物的制备：在1ml10mg/mlNaIO₄溶液中，加入0.5ml溶解SSa5.0mg的甲醇溶液，室温避光搅拌反应1h。将反应混合物加至1ml5mg/ml的HSA溶液(50mmol/L碳酸盐缓冲液，pH9.6)中，用1mol/L的Na2CO3溶液调节至pH9左右，搅拌12h，对水透析5次。