[发明专利]一种中华鳖早期性腺石蜡切片的制作方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种石蜡切片的制作方法，尤其涉及一种中华鳖早期性腺石蜡切片的制作方法。

背景技术

爬行动物的原始生殖细胞，经过分化、迁移进入生殖嵴或原始性腺分化成生殖细胞，而原始生殖细胞的起源要追溯到胚胎早期发育阶段，不同动物原始生殖细胞进入生殖嵴的迁移方式不同，在生殖嵴(生殖腺原基)发生时，原始生殖细胞在生殖嵴中进行分化，原始生殖细胞在迁移过程中不断分裂增殖，随胎龄增长，性别发生分化，生殖嵴分化为雄性的睾丸或雌性的卵巢，原始生殖细胞形成精子或卵子。

中华鳖(Pelodiscus sinensis)，又称甲鱼、王八、水鱼、元鱼、团鱼、脚鱼和老鳖，隶属脊椎动物亚门(Vertebtata)、爬行纲(Reptilia)、龟鳖目(Chelonia)、鳖科(Trionychidae)，广泛分布于我国除宁夏、新疆、青海及西藏外的其它各省，以长江流域和华南地区为多见，是我国养殖最广泛的水生爬行动物，具有重要的经济和药用价值；国外分布于日本、朝鲜和越南。中华鳖营养丰富，肉味鲜美，又是珍贵的药材，其成分含动物胶、角蛋白、维生素D及碘等，具有滋阴清热，平肝益肾、破结软坚及消淤功能。鳖头、甲、肉、胆、血等可入药。研究中华鳖原始生殖细胞的起源、迁移以及性腺分化发育的机制，可为中华鳖的生产活动尤其是雄性化苗种选育提供可靠的理论依据和技术指导。

但是，由于中华鳖自孵化开始，至最初的原始生殖细胞开始迁移、生殖嵴形成、性腺开始分化、精巢或卵巢形成，分别需要孵化至第3、5、16和22天。在胚胎期以及出壳后3月之内，雌性和雄性性腺在外形上非常相似，难以用肉眼来判断。因此，用组织学方法就成为了一种简单而可靠的研究手段。另外，中华鳖胚胎早期性腺分化和性别决定的机理研究还少有报道。因此，通过常规石蜡组织切片的方法为详尽研究中华鳖胚胎早期性腺分化和性别决定提供了可靠的条件。但由于中华鳖早期性腺体积微小，采用传统的石蜡切片操作过程中，通常会出现如下问题：(1)性腺组织颜色浅，在组织透明后更加不易被观察到，很容易丢失；(2)操作过程中容易使性腺损伤，从而破坏了性腺的完整性；（3）性腺组织体积小，不容易操作。为了解决这些问题，就需要对传统的石蜡切片技术作进一步的改进。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术现状而提供一种方法简单易行并能够最大程度地保持性腺的完整性的中华鳖早期性腺石蜡切片的制作方法。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种中华鳖早期性腺石蜡切片的制作方法，包括①样品固定、②脱水与透明程序、③透蜡和包埋、④切片和展片、⑤染色与封片，其特征在于：将步骤①中的样品包埋于经固定液预处理的豆制品中。

具体地，所述豆制品的预处理包括如下步骤：先将豆制品进行切块处理，切成厚度为3mm～2cm的方型平板状，然后再切成截面积为0.5cm²～6cm²的细条，用固定液固定6h～96h后在0.1%～10%的盐酸溶液中浸泡0.5h～96h，最后在流水中冲洗后浸泡于50%～80%的酒精溶液中。

进一步地，所述步骤①～⑤的具体处理如下：

①样品固定：收集中华鳖胚胎发育中后期胚胎的性腺-中肾-肾上腺的复合体，将取出的复合体立即投入到固定液中固定，固定0.5h～24h之后转移到50%～80%酒精溶液中保存；

②脱水与透明程序：将步骤①的中华鳖性腺预包埋于经固定液预处理的豆制品中并用梯度乙醇脱水；先后采用70％乙醇浸泡1min～60min、80%乙醇浸泡1min～60min、90%乙醇浸泡30s～30min、100％乙醇浸泡1min～60min；然后用体积比为1:1的无水乙醇：二甲苯过渡处理20s～40min，再用二甲苯浸泡处理20s～40min，使之透明；

③透蜡和包埋：用体积比为1:1的二甲苯：石蜡过渡处理30s～10min，56℃～70℃熔点的石蜡透蜡20min～40min，2次；将脱水透蜡后的组织样品进行包埋；

④切片和烤片：用切片机切片，切片厚度控制在4μm～15μm，经35℃～45℃水浴中进行展片，载玻片捞片后放置于35℃～40℃烤片机上进行烤片固定；

⑤染色与封片：染色采用伊红-苏木精复染方法，其中用苏木精染色10s～5min伊红染色5s～5min；然后用中性树胶封片。