[发明专利]一种海马活性糖蛋白的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种糖蛋白的制备方法，尤其是涉及一种海马活性糖蛋白的制备方法。 

背景技术

海马为海龙科动物，性温、味甘、归肝、肾经，属于药食同源类生物，是名贵的海洋滋补药物，在我国素有“北方人参，南方海马”之称，具有极高的经济价值。2005《中国药典》收载原动物主要有五种：线纹海马Hippocampus kelloggi Jordan et Snyder、刺海马H. histrix Kaup、大海马H. kuda Bleeker 、三斑海马H. trimaculatus Leach或小海马（海蛆）H. japonicus Kaup的干燥体。夏、秋二季捕捞，洗净，晒干；或除去皮膜及内脏，晒干。 

海马药用历史悠久，历代古医籍及我国药典历次版本一部（中药部分）均有收载。公元739年，《本草拾遗》古医籍中陈藏器首次使用海马之名；《神农本草》古医籍中记载：海马性温、味甘、无毒，具有强身补肾、舒筋活络、止痛止血、退热生肌、强心明目、祛疾止喘、夫人催生等功能；明代《本草纲目》记载：海马雌雄成对，其性温暖，有交感之意，故难产及阳虚房中方术多用之，具有暖水脏、壮阳道之功能。现代医学已经证明海马具有较高的营养价值和化学活性成分，含有大量的镁、钙，其次为锌、铁、锶、锰，少量的钴、镍、铜和铬，还含有大量的硬脂酸、胆甾醇、胆甾二醇，其不饱和脂肪酸占总脂肪酸比例较高，其中多烯不饱和脂肪酸EPA（二十碳五烯酸）和DHA（二十二碳六烯酸）较为丰富。海马具有补肾壮阳、调气活血等功效，临床上主要用于治疗阳痿、遗尿、虚喘、症积等。目前对海马化学成分的研究主要集中在氨基酸、微量元素、磷脂、脂肪酸和甾体类等，对水溶性组分的研究较少，所以海马水溶性组分的研究有利于人们对海马的认识更加完整。 

海洋拥有特殊的生态环境，赋予了海洋生物异于陆生生物所特有的化学成分和结构，具有特异的高活性、高药效。近年来对海洋药物的研究越发深入，越来越多的研究发现糖蛋白具有很好的医疗保健功效，具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎、降血脂、提高免疫力等活性。糖蛋白涉及细胞的定向归巢、糖蛋白毒素及激素作用机制，可使药物选择性地集中到病灶，提高药效，而不影响正常组织的生长和免疫系统的功能，降低不良反应。海马蛋白质含量丰富，高达70%左右。现代科学已证明80%以上的蛋白质都是糖蛋白，包括许多酶、激素、毒素、载体蛋白、免疫球蛋白、结构蛋白、凝集素、受体、粘液组分等，甚至过去人们一直认为是“纯”的多糖，如糖原和纤维素，亦含有少量共价结合的蛋白质。目前，国内外对海马糖蛋白的制备的研究还未见相关报道。 

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种具有高效、快速并能保持糖蛋白活性的海马糖蛋白制备方法。 

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种海马活性糖蛋白的制备方法，包括以下步骤： 

（1）海马前处理：将海马洗净冻好后，于-40℃下冷冻干燥48-72h，再用粉碎机粉碎，然后采用CO₂超临界流体萃取技术脱除脂肪酸，得到脱脂海马粉；

（2）海马糖蛋白提取：将步骤（1）得到的脱脂海马粉与NaCl浓度为0～0.25mol/L的浸提液按（10～35）g：1mL的比例混合于锥形瓶中摇匀后，首先进行超声波辅助提取20min，再置于水浴锅中于30℃～80℃下浸提1～6h后，用滤纸过滤，得到的上清液即为海马糖蛋白混合溶液；

（3）海马糖蛋白粗纯化：将步骤（2）得到的海马糖蛋白溶液减压浓缩至原体积的四分之一，得到糖蛋白样品液，将糖蛋白样品液采用Sevage法除游离蛋白，脱蛋白一次，4℃静置过夜，弃下层游离蛋白层；收集上层糖蛋白溶液，进行乙醇分级沉淀，然后将沉淀收集，将沉淀用丙酮、乙醚各洗涤2次，然后用蒸馏水复溶至8-12mL，再用3500Da透析袋透析72h脱盐，冷冻干燥，得到海马糖蛋白粗纯品。

 步骤（1）中所述的CO₂超临界流体萃取技术进行脱脂的条件为：载气为高纯度CO₂，萃取压强35MPa、萃取时间135min、萃取温度58℃、分离釜温度80℃、CO₂流量15L/h，其中萃取时间依次由动态萃取10min和静态萃取125min组成。 

步骤（2）中所述的超声波辅助提取的条件为：超声功率500W，超声时间20min。