[发明专利]博来霉素抗性报告基因突变体及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及医学诊断和生物技术，特别涉及通过对博来霉素抗性报告基因进行插入突变，以获得可同时用于原核体系和真核体系的既可定性也可定量的核酸酶活性检测技术细胞筛查技术。

背景技术

锌指核酸酶（Zinc finger nuclease），归巢核酸酶(meganuclease)，反因子核酸酶(TAL nuclease)和CRISPR-Cas核酸酶，都是可以进行基因工程设计的新酶类，在基因剪辑中具有十分重要的作用，可用于物种基因的改造、动物模型的制备、细胞株的制备，以及基因治疗研究和临床应用。

在上述基因工程酶中，锌指核酸酶历史较长，由于操作复杂和脱靶效应较高，应用受到一定限制。而CRISPR-Cas核酸酶结构简单，易于操作，但同样存在高的脱靶效应。反因子核酸酶则具有较低的脱靶效应。

转录激活样效应因子（Transcription activator–like effectors,TALE）为近年发现的一类可识别碱基的氨基酸序列高度重复蛋白质，来源于一种革兰氏阴性细菌，每一重复单元大多由33-35个氨基酸组成，其中第12和13位氨基酸共同负责识别1个碱基，目前广泛使用的识别单元为四种，即NI识别A,HD识别C,NG识别T,NN识别G或A。这种与核酸碱基具有确切互补识别关系的生物模块，可用于构建人工转录因子或基因工程酶，在工农业和生物医学中具有十分重大的理论和应用价值。

由转录激活样因子与FokI酶的核酸酶裂解中心所形成的反因子核酸酶（TAL effector nucleases,TALENs），在物种基因改造，基因治疗等多方面已显示出其他工程酶如锌指蛋白酶与归巢核酸酶所无法比拟的优势。尽管反因子核酸酶的脱靶效应较低，但当最终研究目的为用于基因治疗时，则为了避免相关基因治疗的可能毒副作用必须进行全基因组脱靶效应的检测。现有技术采用的脱靶效应检测方法如错配双链检测法，不但敏感性低和效率较低，而且不能对脱靶效应进行定位和对全基因范围进行检测。

为了解决上述现有技术存在的缺陷，本发明由此而来。

发明内容：

本发明所要解决的第一方面的技术问题在于提供一种博来霉素抗性报告基因突变体，其中，在博来霉素基因的起始密码子ATG和其后的第一个氨基酸密码子GCC之间插入一定长度的异源靶序列核苷酸片段。

优选地，所述一定长度的异源核苷酸片段是指大于等于1bp碱基并小于1kb碱基的非3整数倍的或大于等于1bp碱基并小于1kb碱基的3的整数倍且含终止密码子异源靶序列核苷酸片段。

优选地，所述一定长度的异源核苷酸片段是指大于等于1bp碱基且小于1kb碱基的3的整数倍的异源靶序列核苷酸片段。

优选地，所述异源靶序列核苷酸片段为核酸酶靶序列。

本发明所要解决的第二方面的技术问题在于提供一种载体，其含有前述的博来霉素抗性报告基因突变体。

优选地，所述载体为质粒。

本发明所要解决的第三方面的技术问题在于提供一种细胞，其含有前述的博来霉素抗性报告基因突变体或前述的载体。

优选地，所述细胞为大肠杆菌或哺乳动物细胞。

本发明所要解决的第四方面的技术问题在于提供所述博来霉素抗性报告基因突变体或前述载体用于核酸酶活性和脱靶效应的检测。

优选地，博来霉素抗性报告基因突变体插入大于等于1bp碱基并小于1kb碱基的非3整数倍的或大于等于1bp碱基并小于1kb碱基的3的整数倍且含终止密码子的异源靶序列核苷酸片段，导致其阅读框架改变，博来霉素抗性消失。

优选地，博来霉素抗性报告基因突变体插入大于等于1bp碱基且小于1kb碱基的3整数倍的异源靶序列核苷酸片段，不导致其阅读框架改变与阅读框架的提前终止，博来霉素抗性不消失。

本发明所要解决的第五方面的技术问题在于提供博来霉素抗性报告基因突变体或前述载体用于剪辑后的原核或真核细胞株系的阳性筛选。

本发明所要解决的第六方面的技术问题在于提供所述博来霉素抗性报告基因突变体的制备方法，其包括如下步骤：

(1)扩增或者合成得到起始密码子ATG后含有限制性内切酶位点的博来霉素抗性报告基因片段，

(2)将上述步骤得到的博来霉素抗性报告基因片段插入到具有至少另一种抗性报告基因的质粒中，

(3)将步骤（2）中得到的质粒酶切，在博来霉素基因的起始密码子ATG和其后的第一个氨基酸密码子GCC之间插入待检测的异源靶序列核苷酸片段。