[发明专利]博来霉素抗性报告基因突变体及其制备方法和应用

权利要求书

1.博来霉素抗性报告基因突变体，其中，在博来霉素基因的起始密码子ATG和其后的第一个氨基酸密码子GCC之间插入一定长度的异源靶序列核苷酸片段。

2.根据权利要求1所述的博来霉素抗性报告基因突变体，其中，所述一定长度的异源核苷酸片段是指大于等于1bp碱基并小于1kb碱基的非3整数倍的或大于等于1bp碱基并小于1kb碱基的3的整数倍且含终止密码子异源靶序列核苷酸片段；

或者，所述一定长度的异源核苷酸片段是指大于等于1bp碱基且小于1kb碱基的3的整数倍的异源靶序列核苷酸片段。

3.权利要求1所述的博来霉素抗性报告基因突变体，其中，所述异源靶序列核苷酸片段为核酸酶靶序列。

4.一种载体，其含有权利要求1-3任一项的博来霉素抗性报告基因突变体，

所述载体为质粒。

5.一种细胞，其含有权利要求1-3任一项的博来霉素抗性报告基因突变体或权利要求4所述的载体，其中，所述细胞为大肠杆菌或哺乳动物细胞。

6.权利要求1-3任一项所述博来霉素抗性报告基因突变体或权利要求4所述载体用于核酸酶活性和脱靶效应的检测。

7.根据权利要求6所述的用途，其中，博来霉素抗性报告基因突变体插入大于等于1bp碱基并小于1kb碱基的非3整数倍的或大于等于1bp碱基并小于1kb碱基的3的整数倍且含终止密码子的异源靶序列核苷酸片段，导致其阅读框架改变，博来霉素抗性消失；

或者，博来霉素抗性报告基因突变体插入大于等于1bp碱基且小于1kb碱基的3整数倍的异源靶序列核苷酸片段，不导致其阅读框架改变与阅读框架的提前终止，博来霉素抗性不消失。

8.权利要求1-3任一项所述博来霉素抗性报告基因突变体或权利要求4所述载体用于剪辑后的原核或真核细胞株系的阳性筛选。

9.制备权利要求1-3任一项所述博来霉素抗性报告基因突变体的方法，其包

括如下步骤：

(1)扩增或者合成得到起始密码子ATG后含有限制性内切酶位点的博来霉素抗性报告基因片段，

(2)将上述步骤得到的博来霉素抗性报告基因片段插入到具有至少另一种抗性报告基因的质粒中，

(3)将步骤（2）中得到的质粒酶切，在博来霉素基因的起始密码子ATG和其后的第一个氨基酸密码子GCC之间插入待检测的异源靶序列核苷酸片段。

10.根据权利要求9所述的制备方法，其中，所述步骤（1）中以具有博来霉素抗性报告基因的质粒为模版扩增；

所述步骤（3）中，所述异源靶序列核苷酸片段为合成的核酸酶靶序列，且核酸酶靶序列粘性末端为:5’NNNNNNNGCCAA3’；和3’NNTACNNNNNNN5’。