[发明专利]一种比伐卢定中三氟乙酸的含量测定方法

说明书

技术领域：

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种高效液相色谱法测定比伐卢定中三氟乙酸含量的方法。

背景技术：

比伐卢定为新型抗凝药，抗凝成分是水蛭素衍生物（片段），系一合成20肽，相对分子量2180。本品为凝血酶直接的、特异的、可逆性抑制剂。无论凝血酶处于血循环中还是与血栓结合，本品均可与其催化位点和阴离子结合位点（又称底物识别位点）发生特异性结合，从而直接抑制凝血酶的活性。因凝血酶可水解本品多肽顺序中Arg3和Pro4之间的肽键，使本品失活，所以本品对凝血酶的抑制作用是可逆而短暂的，大大降低了临时抗凝带来的出血风险，使该药在高危患者中也得到了广泛的应用，取得了较好的临床应用效果。

在比伐卢定的合成工艺中，为保护比伐卢定的氨基游离而遭受氧化而变质，最后一步是将比伐卢定制成三氟乙酸盐，以保证比伐卢定的质量。通过检测比伐卢定中三氟乙酸的含量，来保证其均已成盐（全部成盐后，三氟乙酸的理论含量为9.5%）。

三氟乙酸的含量测定方法多采用气相色谱法，由于三氟乙酸的极性大，酸性强，所以对气相色谱柱损伤大，分析成本高，且效果不很理想。而用氧瓶燃烧法测定氟的含量，操作繁琐且误差较大。也可以考虑用强酸型阳离子交换色谱柱测定三氟乙酸的含量，但也不是实验室常用手段。

目前比伐卢定中三氟乙酸的含量测定已发表（高效液相色谱法测定比伐卢定中三氟乙酸含量，中国生化药物杂志，2010年第30卷第2期）的方法为HPLC法，具体如下：

精密称取三氟乙酸对照品适量，用流动相配制成每1ml中含0.5mg三氟乙酸的溶液，作为对照品溶液；精密称取比伐卢定适量，用流动相配制成每1ml中含比伐卢定5mg的溶液，作为供试品溶液。照高效液相色谱法（中国药典2010年版二部附录V D）测定。用十八烷基硅烷键合硅胶（C18柱）为填充剂，以0.07%磷酸溶液（pH3.0）-甲醇（98:2）为流动相；流速为1.0ml/min；柱温为30℃；检测波长为210nm。分别精密量取供试品溶液和对照品溶液各20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算，得到样品中三氟乙酸的含量。

经研究发现，在实际操作过程中，上述方法存在不足：采用上述流动相无法将比伐卢定从C18柱上洗脱下来，虽多次进样尚未发现其对三氟乙酸测定存在干扰，但主峰未洗脱易使色谱柱污染而减少其寿命。

发明内容：

为了解决上述问题，本发明的技术方案是提供了一种检测方法，克服了比伐卢定不易从色谱柱上洗脱下来的缺点。本发明的技术方案特点是：以磷酸溶液为流动相A，甲醇为流动相B，其中，流动相A为0.05%～0.10%磷酸溶液，磷酸溶液要用10%氢氧化钠溶液调pH值至3.01～4.00；采用梯度洗脱的方式，该梯度洗脱的方式很容易将比伐卢定从色谱柱上洗脱下来。

本发明的具体的梯度洗脱的方式，包括流动相浓度，洗脱时间如下表：

其中优选梯度洗脱的方式，包括流动相浓度，洗脱时间如下表：

本发明通过梯度洗脱的方式，使得比伐卢定能够从C18柱上洗脱，并且确保了三氟乙酸和比伐卢定的分离度符合要求，从而确保了比伐卢定原料的质量可控（结果见附图1-3）。

本发明还对比伐卢定中三氟乙酸的含量测定方法进行了深入研究：

1.色谱条件的选择

（1）流动相

我们通过实验比较了以0.07%磷酸溶液（pH3.0）-甲醇（98:2）为流动相和以0.05%～0.10%磷酸溶液（用10%氢氧化钠溶液调pH值至3.01～4.00）为流动相A，甲醇为流动相B，进行梯度洗脱的流动相测定样品的色谱图。以0.07%磷酸溶液（pH3.0）-甲醇（98:2）为流动相的样品色谱图，比伐卢定峰未洗脱出；而以0.05%～0.10%磷酸溶液（用10%氢氧化钠溶液调pH值至3.01～4.00）为流动相A，甲醇为流动相B，进行梯度洗脱的流动相测定样品的色谱图，基线平稳，三氟乙酸与比伐卢定完全分离，峰型对称，响应高（见图1和图2）

（2）样品浓度

为了能准确的检测出样品中所含三氟乙酸的量，我们分别比较了进样量为20μl浓度为5mg/ml，10mg/ml和15mg/ml的供试品的色谱图和三氟乙酸含量，实验结果表明，浓度为10mg/ml的样品测得三氟乙酸含量最高，且主峰峰型对称没有过载，因此确定比伐卢定中三氟乙酸含量测定样品浓度为10mg/ml。

2.检测条件的验证