[发明专利]一种酶标免疫试剂盒及其在血清检测中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及免疫试剂盒领域，具体涉及一种酶标免疫试剂盒及其在血清检测中的应用。

背景技术

ELISA法是免疫诊断中的一项新技术，现已成功地应用于多种病原微生物所引起的传染病、寄生虫病及非传染病等方面的免疫诊断。也已应用于大分子抗原和小分子抗原的定量测定，具有灵敏、特异、简单、快速、稳定及易于自动化操作等特点。不仅适用于临床标本的检查，而且由于一天之内可以检查几百甚至上千份标本,因此，也适合于血清流行病学调查。不仅可以用来测定抗体，而且也可用于测定体液中的循环抗原，所以也是一种早期诊断的良好方法。因此ELISA法在生物医学各领域的应用范围日益扩大。

在ELISA方法中，过氧化物酶的活性通常是通过过氧化物酶催化过氧化氢（H₂O₂）氧化底物（如四甲基联苯胺TMB）获得的有色产物，用比色法测定有色产物。后来发现基于在H₂O₂和增强剂的存在下，辣根过氧化物酶（HRP）能够催化氧化鲁米诺，发生“增强化学发光反应”，各种化学发光方法测定酶活的免疫酶试剂盒应运而生。之所以这些增强化学发光反应免疫酶试剂盒得到广泛应用，是因为此法较比色检测免疫法灵敏度要高，且在没有增强剂存在的条件下，HRP催化产生的化学发光信号较低。目前，在HRP催化发光体系中，使用的最为广泛的增强剂是对碘苯酚（PIP）。但是，反应动力学研究表明，HRP催化的H₂O₂氧化鲁米诺反应检测到的化学发光强度不稳定。刚开始，在很短时间内，发光强度迅速增强并达到最大值，然后很快降低。这种衰减是由底物氧化反应自由基产物与HRP的连接使得HRP的失活所致。因此，HRP催化致使的鲁米诺氧化反应产生的化学发光信号不稳定。

发明内容

本发明的目的是提供一种酶标免疫试剂盒，采用大豆过氧化物酶（SBP）为标记酶，MORPH和SPTZ为增强剂，解决了现有技术中HRP催化致使鲁米诺氧化反应产生的化学发光信号不稳定的问题。本发明还提供了该酶标免疫试剂盒在血清检测中的应用。

为解决上述问题，本发明采用以下技术方案：

一种酶标免疫试剂盒，包括抗体预包被反应板、酶标抗体和发光底物液，所述酶标抗体以大豆过氧化物酶为标记酶；所述发光底物液包括H₂O₂、鲁米诺和增强剂；所述增强剂为MORPH（4-马琳吡啶）和SPTZ（3-（10′-吩噻嗪基）丙基-1-磺酸盐）。

所述抗体预包被反应板经过如下步骤制备得到：

步骤一、孔板的修饰

选用全黑的96孔酶标板，修饰抗体缓冲液选用pH9.6的碳酸盐，将100μL浓度为5μg/mL Ab1抗体加入所述96孔酶标板中包被，4℃过夜孵育；PBST充分洗涤三次，PBS再洗涤三次，轻轻拍干，4℃保存；

步骤二、封闭非特异性活性位点

用200μL2%BSA加入到步骤一制备得到的固定有Ab1抗体的96孔酶标板内，室温封闭2h，PBS洗涤三次，轻轻拍干，4℃保存，其中，所述2%BSA为PBS配制；

其中，步骤一和步骤二涉及的PBS为10mM pH7.4，PBST为PBS配制的0.1%Tween。

所述酶标抗体采用改良过碘酸钠法制备得到：

步骤一、取1mg大豆过氧化物酶溶于100μL PBS中，加入新配制的12.8mg/mLNaIO₄溶液50μL，混匀，置室温15min；

步骤二、取出步骤一得到的溶液，后加入9μL/mL乙二醇PBS溶液50μL，室温放置30min；

步骤三、向步骤二得到的溶液中加入含2mg纯化Ab2抗体，混匀，并装入透析袋，于50mM pH9.6碳酸盐缓冲液4℃透析18h，使大豆过氧化物酶和Ab2抗体结合；

步骤四、向步骤三得到的溶液中加入5mg/ml NaBH₄溶液20μL，混匀，置4℃还原2h；

步骤五、缓慢加入和步骤四得到的溶液等体积的饱和硫酸铵溶液，轻摇盐析0.5h，132000g离心15min，去上清，沉淀以少许PBS溶解，装入透析袋，于大量PBS中4℃透析过夜；

步骤六、次日取出离心，以除去不溶物，上层清夜即得大豆过氧化物酶-Ab2抗体结合物，以PBS加至500μL；

步骤七、效价测定合格后，加入等量甘油，分装小瓶，低温保存；

其中，步骤一至七涉及的PBS为10mM pH7.4。