[发明专利]一种核酸扩增反应试剂的冻干保护剂及冻干方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种核酸扩增反应试剂的冻干保护剂及冻干方法。

背景技术

环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是2000年开发的一种新颖的恒温核酸扩增方法，该技术不同于常规PCR思路，其依赖于针对靶序列上的特异区域设计几组特异引物和一种具有链置换特性Bst DNA聚合酶，在等温条件下通过引物自身独特的反转结合，Bst DNA聚合酶进行链的自动循环置换DNA的经典扩增反应，具有简单、快速、特异性强的特点。目前，已有多种环介导等温扩增试剂盒上市，广泛应用于各种病毒、细菌、寄生虫等引起的疾病检测、食品化妆品安全检查及进出口快速诊断中。

反转录环介导等温扩增技术(RT loop-mediated isothermal amplification，RT-LAMP)是将RNA的逆转录（RT）和cDNA的环介导等温扩增技术（LAMP）相结合的技术。RT-LAMP技术有较高的灵敏度、操作方便。目前，已有多种反转录环介导等温扩增试剂盒用于RNA病原的定性和定量检测中。

滚环扩增技术（rolling circle amplification，RCA）是新近发展起来的一种恒温核酸扩增方法。以环状DNA为模板，通过一个短的DNA引物（与部分环状模板互补），在酶催化下将dNTPs转变成单链DNA，此单链DNA包含成百上千个重复的模板互补片段。这种方法不仅可以直接扩增核酸，还可以实现对靶核酸的信号放大，灵敏度较高，因此在核酸检测中具有很大的应用价值和潜力。

依赖于核酸序列恒温扩增技术(nucleic acid sequence—based amplification，NASBA)是一种扩增RNA的新技术,是由一对引物介导的、连续均一的、体外特异核苷酸序列等温扩增的酶促反应过程。该技术具有操作简单、特异性强、灵敏度高、不易被污染等优点，目前已广泛应用于病毒、细菌、霉菌、寄生虫和细胞因子等的检测。在动物疫病预防控制方面，NASBA方法已成为诊断禽流感病毒的国家诊断标准方法之一。同时，在植物病害防疫检查等方面也有重要用途。

聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)是一种分子生物学技术，用于放大扩增特定的DNA片段。利用DNA在体外高温时变性会变成单链，低温时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度，DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。PCR的特点是：特异性强、灵敏度高、简便快速、纯度要求低，广泛用于疾病和肿瘤等的检测。

反转录PCR（Reverse Reaction，RT-PCR）又称为逆转录PCR,是将RNA的逆转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增反应（PCR）相结合的技术。能够使RNA检测的灵敏性提高几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞/组织中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列等。

实时荧光定量PCR技术(Real-time PCR)于1996年由美国Applied Biosystems公司推出。指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点，目前已得到广泛应用。

目前，多种核酸扩增方法被广泛应用在病原体的检测上，但是核酸扩增反应试剂在常温环境下保存不稳定，仅一个月就失效，在2～8℃条件下保存，保存期也只有三个月左右，而且在-20℃条件下的保存期也较不理想。这就要求等温扩增反应试剂在保存、运输和使用过程中尽可能在低温条件下进行，否则诊断试剂容易失效，因此试剂盒的长期保存和长途运输将会受到很大的限制，容易因诊断试剂保存温度不当而使其敏感性下降甚至完全失效，最终导致疫病的检测不及时而造成疫病流行。

目前，针对核酸扩增反应试剂缺少能在4℃或室温长期保存的方法。