[发明专利]一种双菌株联合发酵生产L-缬氨酸的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物制造L-缬氨酸技术，具体地说涉及一种双菌株联合发酵制备L-缬氨酸的方法。

背景技术

L-缬氨酸作为支链氨基酸，是人体必需氨基酸之一，具有多种生理功能，广泛应用于医药、食品及调味剂、动物饲料和化妆品的制造，尤其是在医学研究和治疗中的作用，日益受到重视。国外，L-缬氨酸是合成N-乙酰缬氨酸的医药中间体，高纯度的L-缬氨酸用途更广，附加值高。国内外大批量生产L-缬氨酸均采用微生物发酵法。目前，L-缬氨酸生产菌种较多。其中，某些短杆菌生产菌中的重要代谢路径改变较小，因此代谢活力强，产酸水平高，但是副生杂酸多，尤其是副生L-亮氨酸、L-异亮氨酸等，这对后提取高纯度L-缬氨酸造成很大的困难。另外某些生产菌通过定向诱变，使得生产菌在发酵过程不副生L-亮氨酸与L-异亮氨酸，并且在发酵过程中不断消耗培养基中的L-亮氨酸与L-异亮氨酸，使得发酵液纯度高，有利于高纯度L-缬氨酸的提取，但是产酸水平可能并不理想。因此，找到一种既能够提高发酵液中的纯度，又能达到高产酸的发酵方法对工业化生产高纯度L-缬氨酸有着重要意义。

CN200610013535.8黄色短杆菌突变株及用于发酵法生产L－缬氨酸的工艺公开黄色短杆菌突变株及用于发酵法生产L－缬氨酸的工艺。以黄色短杆菌(Brevibacteriumflavum)HL41(CICC10135)为出发菌种，选育具有遗传标记(Ile^－+Leu^－+SG^r+α－AB^r+2－TA^r)的突变株TV230，使其具有L－缬氨酸的生物合成能力。用黄色短杆菌突变株TV230经扩培、发酵培养、及L－缬氨酸的提取步骤可得到L－缬氨酸粗品，进一步精制可得到L－缬氨酸纯品。但收率低，纯度低。

发明内容

本发明的目的是提供一种由双菌株联合发酵生产L-缬氨酸的方法，利用产酸能力强的黄色短杆菌和产酸纯度高的重组大肠杆菌联合发酵生产L-缬氨酸，该方法比单一菌种的产酸水平和发酵液纯度都有显著提高。

本发明采用两株L-缬氨酸生产菌：黄色短杆菌和重组大肠杆菌。发酵步骤如下：

（1）将黄色短杆菌接种于种子培养基上，进行种子扩大培养得种子液；

（2）将重组大肠杆菌接种于种子培养基上，进行种子扩大培养得种子液；

（3）将步骤（1）培养的种子液接入灭好菌的发酵培养基中发酵得发酵液，发酵至菌体活力下降，发酵过程补加糖液；

（4）将步骤（2）培养的种子液接入步骤（3）中的发酵液中，并补加营养液，继续发酵。

具体地说，本发明提供的一种由双菌株联合发酵生产L-缬氨酸的方法如下：

（1）采用的菌种为：

黄色短杆菌XQ6（Leu^l,Ile^l,AHV^r,α-AB^hr,2-TA^hr）

重组大肠杆菌，该菌种为本领域技术人员常用的亮氨酸、异亮氨酸营养缺型的重组大肠杆菌。

（2）配制种子培养基

黄色短杆菌种子培养基，葡萄糖20g、蛋白胨10g、玉米浆20g、硫酸铵5g、磷酸二氢钾0.5g、七水硫酸镁0.5g，定容1L，pH6.8，121℃20分钟。

重组大肠杆菌种子培养基，葡萄糖20g、玉米浆35g、硫酸铵5g、磷酸（85%）1.2ml、氯化钾1g、七水硫酸镁0.5g、L-亮氨酸70mg、L-异亮氨酸21mg，定容1L，pH6.8，121℃20分钟。

（3）配制发酵培养基

葡萄糖60g/L、氨基酸粉10g/L、玉米浆20g/L、硫酸铵5g/L、磷酸二氢钾0.5g/L、七水硫酸镁0.5g/L、硫酸锰7mg/L、硫酸亚铁7mg/L。

（4）配制营养液

酵母膏9g、磷酸（85%）2.4ml、氯化钾2g、L-异亮氨酸0.3g，定容100ml，121℃灭菌20分钟。

（5）将两株生产菌分别接入各自的种子培养基中，培养12-24小时，培养温度分别是黄色短杆菌30±2℃，重组大肠杆菌37±2℃，在发酵过程中，注意控制氧溶解饱和度，以发酵0h未接种时液体发酵培养基的氧溶解饱和度设为100%，实消高温保压状态下的液体发酵培养基的氧溶解饱和度设为0%；通过调节风量和发酵罐搅拌转速来实现。