[发明专利]一种基于鲁米诺和联吡啶钌的电位分辨电致化学发光检测方法及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体地说涉及一种基于鲁米诺和联吡啶钌的电位分辨电致化学发光检测方法及其应用。

背景技术

电致化学发光（ECL）是另外一种应用于免疫分析的方法，其利用电致化学发光探针代替荧光团。电致化学发光方法不需要光源的激发，因此具有背景低和设备简单的优点。最常用的电致化学发光探针为鲁米诺和联吡啶钌。一般情况下，在施加正电位时，鲁米诺阴离子会经历单电子氧化过程，变为二氮杂醌，进一步被氧化为激发态的3-氨基邻苯二甲酸，从而回到基态发光。对于联吡啶钌探针来说，S₂O₈^2-离子作为共反应剂，首先会在负电位下被还原成为SO₄·-，该物质可与联吡啶钌反应从而发光。虽然联吡啶钌/过硫酸根离子体系和鲁米诺/双氧水体系会在不同的电压范围下发光，两种电致化学发光物质和其相应的共反应剂同时存在于一个体系当中造成了复杂的电化学发光现象，进而分辨来自鲁米诺和联吡啶钌复合物的发光变得十分困难。

癌症的早期诊断对其最终的控制和预防有着至关重要的作用。在癌症发展的过程中，一种有效的早期癌症诊断手段是对癌症标志物的检测。由于已知的癌症标志物的特异性较低，因此对多标志物的同时检测可以大大提高癌症检测的准确性。过去的几年中研究者致力于发展基于荧光免疫方法对多个癌症标志物的同时检测。经典的做法是在细胞表面标记上具有不同激发光/发射光性质的荧光团。在激光的照射下，不同荧光团的发射光被分光镜和滤光片区分开来，之后由光电倍增管（PMT）或者电荷耦合装置（CCD）检测出来。虽然荧光免疫分析法因荧光团覆盖光谱的广泛性，荧光标记的简便性和实时监测性而具有一定的优越性，但是激光器的部件、滤光片或者光学分束器的引入会使得实验设备复杂，提高了检测成本。将电致化学发光反应应用于细胞免疫分析当中时，抗体修饰的联吡啶钌和鲁米诺可以识别细胞表面的抗原。由于不同的电致化学发光探针可在不同的电位下发光，因此发展电位分辨的电致化学发光免疫试剂盒进行细胞表面抗原的同时分析是可行的。电压扫描过程中，不同电致化学发光探针会在不同时间点发光，因此不需要光学分束器或滤光片进行信号的分辨。由于不需要光源、光学分束器和滤光片的引入就很大程度上简化了光学设置并且降低了实验成本。

发明内容

发明目的：为解决现有技术中存在的技术问题，本发明提出一种基于鲁米诺和联吡啶钌的电位分辨电致化学发光检测方法及其应用，以解决两种电致化学发光物质同时存在于一个体系中时分辨两者的发光出现困难的问题，同时将该方法应用于同时检测细胞表面两种抗原。

技术内容：为实现上述技术目的，本发明提出一种基于鲁米诺和联吡啶钌的电位分辨电致化学发光检测方法，以鲁米诺和联吡啶钌为发光探针，在检测时包括如下步骤：

（1）电极准备：在ITO电极表面粘上O型圈作为溶液室，以ITO电极作为发光检测的工作电极，以银-氯化银电极作为参比电极，以铂电极作为对电极；

（2）正电位下检测鲁米诺的发光信号：以-0.01～-1V/s的扫速由0.6V扫描至0.0V，检测来自鲁米诺的发光信号，优选的扫速为-0.2V/s；

（3）负电位下检测联吡啶钌的发光信号：向检测体系中加入过硫酸根和过量的鲁米诺，以-0.01～-1V/s的扫速由0.0V扫描至-1.0V，检测来自联吡啶钌的发光信号，选的扫速为-0.2V/s；

其中，所述鲁米诺的检测范围为20μM～200μM，所述联吡啶钌的检测范围为20μM～200μM；加入的过硫酸根与联吡啶钌的摩尔比为20:1～30:1，加入的过量的鲁米诺的量为15～20mM。

本发明还提出了上述方法在同时检测细胞表面两种抗原上的应用。

具体地，所述应用包括如下步骤：

（1）电极准备：在ITO电极表面粘上O型圈作为溶液室，以ITO电极作为发光检测的工作电极，以银-氯化银电极作为参比电极，以铂电极作为对电极；

（2）将细胞表面待测的抗原A和抗原B分别用联吡啶钌和鲁米诺标记；

（3）对细胞表面的联吡啶钌和鲁米诺进行检测，其中，以-0.01～-1V/s的扫速由0.6V扫描至0.0V，检测来自鲁米诺的发光信号，优选的扫速为-0.2V/s；向检测体系中加入过硫酸根和过量的鲁米诺溶液，以-0.01～-1V/s的扫速由0.0V扫描至-1.0V，检测来自联吡啶钌的发光信号，优选的扫速为-0.2V/s。

其中，在上述步骤（1）中，标记联吡啶钌和鲁米诺的步骤如下：