[发明专利]一种基于鲁米诺和联吡啶钌的电位分辨电致化学发光检测方法及其应用

权利要求书

1.一种基于鲁米诺和联吡啶钌的电位分辨电致化学发光检测方法，其特征在于，以鲁米诺和联吡啶钌为发光探针，在检测时包括如下步骤：

（1）电极准备：在ITO电极表面粘上O型圈作为溶液室，以ITO电极作为发光检测的工作电极，以银-氯化银电极作为参比电极，以铂电极作为对电极；

（2）正电位下检测鲁米诺的发光信号：以-0.01～-1V/s的扫速由0.6V扫描至0.0V，检测来自鲁米诺的发光信号；

（3）负电位下检测联吡啶钌的发光信号：向检测体系中加入过硫酸根和过量的鲁米诺，以-0.01～-1V/s的扫速由0.0V扫描至-1.0V，检测来自联吡啶钌的发光信号；

其中，所述鲁米诺的检测范围为20μM～200μM，所述联吡啶钌的检测范围为20μM～200μM；加入的过硫酸根与联吡啶钌的摩尔比为20:1～30:1，加入的过量的鲁米诺的量为15～20mM。

2.权利要求1所述的方法在同时检测细胞表面两种抗原上的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：

（1）电极准备：在ITO电极表面粘上O型圈作为溶液室，以ITO电极作为发光检测的工作电极，以银-氯化银电极作为参比电极，以铂电极作为对电极；

（2）将细胞表面待测的抗原A和抗原B分别用联吡啶钌和鲁米诺标记；

（3）对细胞表面的联吡啶钌和鲁米诺进行检测，其中，以-0.01～-1V/s的扫速由0.6V扫描至0.0V，检测来自鲁米诺的发光信号；向检测体系中加入过硫酸根和过量的鲁米诺溶液，以-0.01～-1V/s的扫速由0.0V扫描至-1.0V，检测来自联吡啶钌的发光信号。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤（2）中，标记联吡啶钌和鲁米诺的步骤如下：

（a）细胞培养：将细胞在步骤（1）所述的ITO电极的表面培养，并用2.5wt%的戊二醛进行固定；

（b）制备链霉亲和素修饰的联吡啶钌复合物：将链霉亲和素与联吡啶钌在3～5℃下反应2～3小时得到结合产物SA-Ru，结合产物用超滤管进行超滤纯化处理，然后在4℃下于pH7.4的PBS缓冲液中保存；

（c）制备抗体B修饰的鲁米诺复合物：将3-巯基丙酸加入到金纳米颗粒溶液中在35～38℃下反应10～12小时，在转速为14000rpm条件下离心25～40分钟收集金纳米粒子轭合物，向金纳米粒子轭合物中加入EDC和NHS的混合溶液，在36～38℃下反应0.8～1.5小时，得到活化的金纳米粒子溶液；将活化的金纳米粒子溶液与抗体B溶液混合，在36～38℃下反应11～13小时得到金纳米粒子-抗体B复合物；将N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺加入到金纳米粒子-抗体B复合物中，在黑暗条件下反应11～13小时得到抗体B修饰的鲁米诺复合物；

（d）标记链霉亲和素修饰的联吡啶钌复合物：将（a）中固定有细胞的ITO电极与生物素化的抗体A溶液于37℃条件下反应25～40分钟，用pH7.4的PBS缓冲液清洗，加入步骤（b)中得到的SA-Ru溶液反应2～4分钟从而在抗原A上标记上链霉亲和素修饰的联吡啶钌复合物；

（e）标记抗体B修饰的鲁米诺复合物：将经过（d）步骤处理的ITO电极的O型圈表面加入0.02%（w/v）的吐温20溶液，然后与步骤（c）制备的抗体B修饰的鲁米诺复合物在37℃下反应2小时，从而在抗原B上标记上抗体B修饰的鲁米诺复合物。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述O型圈的直径为2cm。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的细胞为MCF-7细胞，所述的抗原A为癌胚抗原，抗原B为甲胎蛋白。

7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的PBS缓冲液为pH7.4的PBS缓冲液。

8.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的金纳米颗粒的粒径为11～13nm。