[发明专利]自体血清抗原致敏DC‑CIK细胞的制备方法

权利要求书

1.自体血清抗原致敏DC-CIK细胞的制备方法，包括以下步骤：

A）自体血清抗原的制备；

B）外周血单个核细胞的制备；

C）DC的分离和培养；

D）CIK细胞的诱导扩增；

E）DC与CIK细胞共培养制备DC-CIK细胞；

所述的A）步骤为取外周血50-100ml，离心分离患者血清，加入终浓度为0.1-1.0mg/ml的亮抑蛋白酶抑制剂进行蛋白浓缩，随后用无菌离心管存储，置于-20℃以下环境冷冻24-48h，取出后在0-4℃环境中放置10-16h，吸取上层血浆部分并弃去；56℃灭活补体成分20-30min，微孔滤膜过滤，得到自体血清肿瘤抗原；

所述步骤C）为依据肿瘤标志物测定结果，在细胞贴壁后加入终浓度为5-20%的步骤A）制备得到的自体血清抗原进行DC致敏，在培养第6至第7天加入终浓度为200-1000ng/ml的肿瘤坏死因子，得到自身抗原致敏后的DC。

2.如权利要求1所述的自体血清抗原致敏DC-CIK细胞的制备方法，其特征是：所述分离血清后蛋白浓缩后的蛋白处理条件为-20℃冷冻48h，随后在4℃环境中竖直放置16h；所述灭活条件为56℃灭活补体成分30min；所述微孔滤膜为孔径为22μm及以下微孔滤膜。

3.如权利要求1所述的自体血清抗原致敏DC-CIK细胞的制备方法，其特征是：所述的B）步骤为采用密度梯度离心法分离获得外周血单个核细胞（PBMC）；采用AIM-V无血清培养基悬浮分离的PBMC，按照0.5-1×10⁸/瓶的数量置于培养瓶中，细胞培养箱中静置1-3h，吸取未贴壁淋巴细胞用于CIK细胞的培养；贴壁细胞用于DC的培养。

4.如权利要求1所述的自体血清抗原致敏DC-CIK细胞的制备方法，其特征是：所述的E）步骤为将上述抗原致敏后的DC与前述CIK细胞混合培养5-8天，收获自体抗原致敏DC-CIK细胞。

5.如权利要求1-4任一项所述的自体血清抗原致敏DC-CIK细胞的制备方法，其特征是：所述DC-CIK细胞的细胞组成为CD3⁺细胞占90%以上，其中CD3⁺CD4⁺细胞在10-20%，CD3⁺CD8⁺细胞在60-80%，CD3⁺CD56⁺细胞在10-20%。