[发明专利]尿液中3-羟乙基腺嘌呤(3-HOEtA)的测定方法

说明书

  

技术领域：

本发明属于尿液样本的理化检验技术领域，主要涉及尿液中3-羟乙基腺嘌呤(3-HOEtA)的测定技术领域，具体说是一种采用液相色谱-电喷雾电离-串联质谱仪（LC-ESI-MS/MS）测定尿液中3-羟乙基腺嘌呤(3-HOEtA)的方法。

  

背景技术：

3-羟乙基腺嘌呤(3-HOEtA)是外源性化合物体内代谢生成的自由基与腺嘌呤结合后的产物。由于尿中内源性3-羟乙基腺嘌呤(3-HOEtA)本底值低，又能较为准确的反映原型化合物的特性，因此作为生物监测指标广泛用于环境烷基化污染物的生物监测。据报道，尿液中3-羟乙基腺嘌呤(N3-(2-hydroxyethyl)adenine， 3-HOEtA)与吸烟水平有较强的相关性，能够用于评价烟气中有害成分亚硝胺的接触水平。

目前，关于尿液中DNA加合物的分析检测方法的报道较多，但是提取、净化、检测尿液基质中多种目标物的高通量分析方法尚不完善。 

  

发明内容：

本发明的目的正是基于上述现有技术状况，采用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）技术建立了尿液中3-羟乙基腺嘌呤(3-HOEtA))的测定方法。该方法具有快速、准确、灵敏度高等特点，可用于尿液中3-羟乙基腺嘌呤(3-HOEtA)的定性定量分析。本发明通过优化前处理及检测条件，建立了提取、检测尿液中3-羟乙基腺嘌呤的方法，适合于分析吸烟与非吸烟人群尿液。在20 min内就可完成3-羟乙基腺嘌呤的分离检测，本方法灵敏，准确，选择性好。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种尿液中3-羟乙基腺嘌呤(3-HOEtA)的测定方法，包括以下具体步骤： 

a、样品前处理：尿液在室温状态下解冻并混合均匀，取4 mL尿液，加入4mL超纯水，加入100 μL内标，用水浴锅调节温度到80℃。取超纯水稀释后的尿液置于固相萃取柱中。所述内标为氘代-3-乙基腺嘌呤，内标浓度为100 ng/mL。

固相萃取用Waters Oasis MCX（6 mL, 500mg）固相萃取柱，预先用2 mL甲醇、5 mL水溶液活化，上样量为8 mL。用2 mL 10％甲醇/水溶液淋洗，然后用1 mL乙酸乙酯淋洗，最后用甲醇/乙酸乙酯/氨水（47.5: 47.5: 5）洗脱，收集洗脱液并于60 ℃下用氮气吹至干，然后用100 μL水溶液溶解，供LC-MS/MS分离分析。 

b、标准工作液的配制：用乙腈配制不同浓度的3-羟乙基腺嘌呤(3-HOEtA)标准工作溶液。 

c、液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）测定，吸取配制好的不同浓度的3-羟乙基腺嘌呤(3-HOEtA)的标准工作溶液，注入LC-MS/MS系统，得到线性回归方程。对样品待测液进行测定，测得分析物与内标峰面积的比值，代入一元线性回归方程，求得样品待测液中分析物的含量。 

本发明选取了Waters HILIC (150 mm x 2.1 mm，2.5 μm)色谱柱，流动相体系选取A:乙腈和B: 10m mol/L甲酸铵/水溶液，A:B为95:5，洗脱时间为20 min，进样量为3 μL。 

质谱条件：电喷雾离子源(ESI)，正离子扫描方式；喷雾(IS)电压为5500 V；雾化气(Gasl)压力为344.5 kPa(50 psi)；气帘气(CUR)压力为206.7 kPa(30 psi)；辅助雾化气(Gas2)压力为310.0 kPa(45 psi)；离子源温度(TEM)为500℃；去蔟电压(DP)为85eV；碰撞能(CE)为26 eV；驻留时间为40 ms。监测离子对为3-HOEtA：180→136（定量离子对），180→119（定性离子对）；内标d₅-3-EtA为169→137。    

本发明具体的工艺过程进一步详述如下：

1、样品前处理