[发明专利]一种利用亚麻刺盘孢霉静息细胞高效催化去氢表雄酮的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种新的利用亚麻刺盘孢霉(Colletotrichum lini ) ST-1静息细胞高效催化去氢表雄酮的方法。 

背景技术

三羟基雄甾烯酮（7α,15α-diOH-DHEA）是合成新型口服避孕药屈螺酮的重要前体， 传统的化学合成方法，步骤繁杂，工艺复杂，且大量有机溶剂的使用也给环境带来了很大的污染。现在通过微生物法催化底物去氢表雄酮（DHEA）就可以一步得到目的产物三羟基雄甾烯酮。简化了反应步骤，同时也减少了有机溶剂的使用。 

但是现有的菌株对底物的转化也存在一定的局限。首先，原始菌株对底物的转化能力较差，并且转化过程存在较多的副产物；其次，去氢表雄酮是疏水性的白色粉末，其在水中的溶解度极低，所以大大限制了转化时底物的投料浓度和底物的转化率。 

发明内容

本发明的目的在于针对现有三羟基雄甾烯酮生产过程中的技术难点及存在的问题，对现有的转化工艺进行改良，希望可以提高底物的利用率，节约生产成本。本发明所述的亚麻刺盘孢霉(Colletotrichum lini ) ST-1保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.6051，分类命名为亚麻刺盘孢霉(Colletotrichum lini ) ，保藏日期为2012年4月24日。 

具体的步骤如下： 

1）  静息细胞的制备

从斜面挑取适量菌丝接种至种子培养基中（250mL的锥形瓶装液量为30mL），在30℃，220rpm的条件下，摇床培养72 h，，然后按8 %-10 % V/V的接种量转接至新的种子培养基中（500mL的锥形瓶装液量为100mL）同上述摇床培养条件，继续培养24 h得到均匀的二级种子，再将二级种子按8 %-10 % V/V的接种量转接至发酵培养基相同摇床条件培养24 h，此时菌体处于对数生长期，离心，菌体用等体积pH 7.0的浓度为0.01M的磷酸钠缓冲液洗涤2遍（以除去发酵液中的其余成分），收集菌体，重新悬浮于pH5.5-7.5的磷酸钠缓冲液中，缓冲液浓度为0.02-0.2 M，制备成细胞浓度为10-12 g/L的静息细胞悬液，待转化使用。

2）静息细胞转化 

取适量（1）中所述的静息细胞悬液，投加底物，底物终浓度为10 g/L，同时添加1 %-2 %的吐温80作为助溶剂（吐温80对底物进行预溶后投料，转化效果一样），30 ℃、220 r/min的摇床条件下转化36 h。

3）  生长细胞转化 

将步骤（1）中制备好的细胞液体培养物以8 %-10 %（w/w）的接种量接入发酵培养基，装液量 30mL/ 250mL，于30℃，220 r/min的转速下培养24 h后，投加底物去氢表雄酮（DHEA）300 mg，30 ℃、220 r/min的摇床条件下继续转化36 h。

4）产物的检测 

均匀取1mL步骤（2/3）中转化液用800 μL的乙酸乙酯进行萃取（可适当利用超声和震荡来提高萃取效率），然后12000 r/min下离心2min，吸取上清液，如此反复萃取5遍，收集上清液，烘干，用8倍体积乙腈复溶，后用0.22 μm的有机膜过滤除杂，最后采用HPLC的方法检测转化结果。高效液相色谱（Agilent TC-C18，4.6×250 mm, 5 μm）的检测条件，流动相：乙腈：水（7:3）；柱温30 ℃；检测波长206 nm；流速0.5 mL/min；进样量10μL。

其中 

步骤（1）中所述的固体培养基的成分及配比为：土豆 200 g/L；葡萄糖20 g/L；琼脂20 g/L；pH自然，补充蒸馏水至1 L，自然pH，121℃下高压蒸汽灭菌20min；

步骤（1）所述种子培养基的成分及配比为：葡萄糖15 g/L；酵母粉15 g/L；玉米浆3 g/L；豆饼粉10 g/L;补充蒸馏水至1 L，自然pH，121℃下高压蒸汽灭菌20min；

步骤（1）所述发酵培养基的成分及配比为：葡萄糖15 g/L；酵母粉15 g/L；玉米浆3 g/L；自然pH，121℃高压蒸汽下灭菌20 min。