[发明专利]一种酶水解-气相色谱-质谱联用测定烟草中糖苷的方法

说明书

技术领域

本发明属于烟草化学分析领域，具体涉及一种酶水解-气相色谱-质谱联用测定烟草中糖苷的方法。 

背景技术

糖苷类物质是潜香物质中重要的一类，是烟草在生长、发育过程中形成的次级代谢产物，主要是由单糖或双糖的还原羟基与香气物质（萜烯醇类、脂肪醇类、C13降异戊二烯类或苯丙烷类衍生物等）键合形成的稳定结合态化合物。它不仅是烟草中挥发性香气成分的重要前驱体（可以通过酶水解或燃烧裂解释放出游离态的香气成分），还具有广泛的生物学功能（如香气成分储存和运输的主要形式、保护细胞中的易损结构、清除活性自由基、抗逆及抗病虫害等作用）。 

现有技术中烟草中糖苷的测定主要采用色谱-质谱联用的分析方法。目前，酸水解-气相色谱-质谱联用（AH-GC-MS）与液相色谱-质谱联用（LC-MS）技术为分析的主要方法。酸水解具有前处理简单，易操作、物质鉴定简单等特点，但酸水解是一种非选择性、破坏性的水解方式，酸水解不仅水解糖苷，其它成分（如糖酯、果胶等）也能水解，从而产生一系列干扰成分，此外，酸水解能使糖苷配基产生重排、裂解、消去等副反应，不利于成分的鉴定。液相色谱-质谱联用技术对很多结构类似的糖苷未能分离，且质谱结构鉴定无商业化的标准谱库与稳定的保留指数进行确证，限制了该技术在该领域上的应用。 

发明内容

本发明拟解决的技术问题如下：针对酸水解条件下对糖苷的破坏性和非选择性，同时液相色谱-质谱对糖苷的分离能力差和定性确证信息少的缺陷，设计优化超声提取-固相萃取净化-酶水解-气相色谱-质谱联用定性定量分析烟草中的糖苷成分，该方法准确，可靠，能准确鉴定24种糖苷和相对定量28种糖苷。该方法与现有方法相比，克服了酸水解的非选择性、破坏性的水解方式，同时也有利于用商业化的标准谱库与文献中的保留指数进行物质确证。此外，优化的酶水解条件，保证了该方法最大的水解程度和水解重复性，提高了方法相对定量的精密度。 

本发明设计一种超声提取-固相萃取净化-酶水解-气相色谱-质谱联用定性定量分析烟草中的糖苷成分，该方法可以同时准确鉴定24种糖苷和相对定量28种糖苷，具有准确度高、重复性好等特点，适合应用于不同类型烟叶中多种糖苷类物质的同时检测。 

本发明对烟草中糖苷的测定方法包含如下步骤： 

（1）提取：称取一定量的烟草粉末于具塞三角瓶中，加入内标1：苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷后加入甲醇超声提取，将样品超声后取上层清液过砂芯滤斗，残留物再用甲醇超声提取一次，合并提取液，在真空、水浴条件下将甲醇浓缩至干；

（2）净化：将XAD-2大孔树脂用去离子水洗至无甲醇气味，再将XAD-2大孔树脂装成固相萃取柱，将上述（1）浓缩物用超纯水溶解后转移至大孔树脂固相萃取柱中，先用水淋洗除去糖、氨基酸等水溶性杂质，再用乙醚淋洗除去非极性杂质，最后用乙酸乙酯洗脱糖苷成分，洗脱液干燥后真空、水浴条件下将乙酸乙酯浓缩至2 mL，再用氮气吹干；

（3）酶水解糖苷：将上述（2）氮气吹干的残留物用缓冲液溶解，用体积比为1:1的乙醚和正戊烷溶液萃取2次后，向缓冲液中加入水解酶和有机溶剂混匀后放入水浴中充分反应，反应结束后冷却至室温；

（4）糖苷水解物提取：加入内标2：4-壬醇，混匀后转移至离心管中，用体积比为1:1的乙醚和正戊烷溶液萃取，有机相干燥后水浴常压浓缩至0.5 mL，待进样；

（5）用气相色谱-质谱对糖苷进行定性及定量分析，定性采用与标准物质、商业化的标准谱库NIST08 和Wiley08和保留指数NIST 数据库进行比对，内标1用于糖苷内标法的相对定量，内标2用于酶水解方法的优化。

其中气相色谱-质谱分析条件如下： 

气相色谱柱为HP-5ms，60m×0.25mm i.d×0.25μm d.f，进样体积：2 μL，进样口温度280 ℃，分流进样，分流比为20:1，载气为氦气，恒流模式，流速为1.0 mL/min，柱温箱为程序升温，60 ℃保持1min，以2 ℃/min升至230 ℃，保持4 min；离子源温度为230 ℃，四级杆温度为150 ℃，电离能70 eV，传输线温度为280 ℃，扫描模式为全扫描，质量范围45-400 amu，溶剂延迟6 min。

本发明中的 XAD-2大孔树脂玻璃柱的规格为Φ2 cm×10 cm。