[发明专利]一种酶水解-气相色谱-质谱联用测定烟草中糖苷的方法

权利要求书

1.一种酶水解-气相色谱-质谱联用测定烟草中糖苷的方法，其特征在于：测定方法包括如下步骤：

（1）提取：称取一定量的烟草粉末于具塞三角瓶中，加入内标1：苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷后加入甲醇超声提取，将样品超声后取上层清液过砂芯滤斗，残留物再用甲醇超声提取一次，合并提取液，在真空、水浴条件下将甲醇浓缩至干；

（2）净化：将XAD-2大孔树脂用去离子水洗至无甲醇气味，再将XAD-2大孔树脂装成固相萃取柱，将上述（1）浓缩物用超纯水溶解后转移至大孔树脂固相萃取柱中，先用水淋洗，再用乙醚淋洗，最后用乙酸乙酯洗脱，洗脱液干燥后真空、水浴条件下将乙酸乙酯浓缩至2 mL，再用氮气吹干；

（3）酶水解糖苷：将上述（2）氮气吹干的残留物用缓冲液溶解，用体积比为1:1的乙醚和正戊烷溶液萃取2次后，向缓冲液中加入水解酶和有机溶剂混匀后放入水浴中充分反应，反应结束后冷却至室温；

（4）糖苷水解物提取：加入内标2：4-壬醇，混匀后转移至离心管中，用体积比为1:1的乙醚和正戊烷溶液萃取，有机相干燥后水浴常压浓缩至0.5 mL，待进样； 

（5）用气相色谱-质谱对糖苷进行定性及定量分析，定性采用与标准物质、商业化的标准谱库NIST08 和Wiley08和保留指数NIST 数据库进行比对，其中气相色谱-质谱分析条件如下：

气相色谱柱为HP-5ms，60m×0.25mm i.d×0.25μm d.f，进样体积：2 μL，进样口温度280 ℃，分流进样，分流比为20:1，载气为氦气，恒流模式，流速为1.0 mL/min，柱温箱为程序升温，60 ℃保持1min，以2 ℃/min升至230 ℃，保持4 min；离子源温度为230 ℃，四级杆温度为150 ℃，电离能70 eV，传输线温度为280 ℃，扫描模式为全扫描，质量范围45-400 amu，溶剂延迟6 min。

2.如权利要求书1所述的一种酶水解-气相色谱-质谱联用测定烟草中糖苷的方法，其特征在于： XAD-2大孔树脂玻璃柱的规格为Φ2 cm×10 cm。

3.如权利要求书1所述的一种酶水解-气相色谱-质谱联用测定烟草中糖苷的方法，其特征在于：缓冲液为pH=5.6的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液。

4.如权利要求书1所述的一种酶水解-气相色谱-质谱联用测定烟草中糖苷的方法，其特征在于：水解酶为β-D-葡萄糖苷酶，>=10 units/mg。

5.如权利要求书1所述的一种酶水解-气相色谱-质谱联用测定烟草中糖苷的方法，其特征在于：酶水解过程中加入的有机溶剂为体积比为1:1的乙醚：正戊烷溶液。

6.如权利要求书1所述的一种酶水解-气相色谱-质谱联用测定烟草中糖苷的方法，其特征在于：酶水解条件为温度为36.8 ℃，溶剂2.1 mL，时间为60 h，pH值为5.6和酶量为1 mg/mL。