[发明专利]纤维素类生物质的降解中的全细胞生物催化剂

说明书

本发明涉及核酸分子，包含以下组分：(1)编码信号肽的部分，(2)编码异源纤维素酶的部分，(3)编码蛋白酶识别位点的任选部分，(4)编码跨膜接头的部分，以及(5)编码自转运体(autotransporter)的转运结构域或其变体的部分。

本发明另外的方面涉及由如上文描述的核酸分子编码的多肽、展示相应多肽在其表面的微生物、以及从此类微生物可获得的膜级分（membrane fraction）。本发明还涉及用于使用微生物或膜级分制备反应产物、尤其是纤维素反应产物的方法，以及还涉及微生物和/或膜制品用于从由纤维素酶所催化的反应制备产物的用途。

纤维素酶是可降解纤维素为它的基本单元β-葡萄糖的酶。纤维素酶仅由降解植物的生物体诸如例如专门的细菌和鞭毛类的一小部分，以及由降解木材的微生物诸如真菌所形成。借助于这些酶，相应微生物能够分解并代谢循环纤维素为降解产物并最终降解为葡萄糖，所述纤维素通常也由3000至15,000个葡萄糖分子组成。纤维素酶包括特别地三种酶类型，其联合作用使纤维素分子能够合理消化：

1.内切纤维素酶（酶类EC3.2.1.4）：这些酶分解纤维素为较大部分并且，不像其他纤维素酶，还可在纤维素链内工作。尤其，内切纤维素酶在“无定形区”内可变得活跃，其中所述纤维素分子相对于彼此是无序的。作为该事件的结果，所述酶产生较大量的链末端。

2.外切纤维素酶（EC3.2.1.91）：这些酶仅将纤维素从其末端分解下来，而不断缩短纤维素链。外切纤维素酶的反应通常导致纤维二糖单元（二糖），而且还导致葡萄糖、纤维三糖或纤维四糖从纤维素链分解下来。

3.纤维二糖酶或β-葡糖苷酶(EC3.2.1.21)：这组酶分解纤维二糖的两个葡萄糖分子之间的β-糖苷键，并且从而使葡萄糖可用于进一步的代谢过程。

提及的三种酶类型，各自都能够独立攻击纤维素类生物质。然而，假定当所述酶类型攻击纤维素类生物质的不同天然结构单元时，它们的组合表现高度协同。尤其，当纤维二糖酶被使用时，可预期降解由内切纤维素酶和外切纤维素酶所提供的纤维二糖、纤维三糖和其他更高的纤维寡糖为葡萄糖，导致酶促催化反应的平衡的位移，并且因此促使更有效的转化。

纤维素和半纤维素是木材和许多植物的主要成分，并因此代表完全可用的原料（freely-available raw material）。然而，材料的转化的一个问题在于分解其为例如葡萄糖的难度，所述问题对材料广泛用于获得生物乙醇造成障碍。在本领域的现有技术中，目前存在用于分解纤维素为葡萄糖的一些纯化的酶，其通常不得不从真菌培养物诸如里氏木霉(Trichoderma reesei)或丙酮丁醇梭菌(C.acetobulyticum)中被分离(参见Shah等人,App.Biochem.Biotech.(1991),第18/29卷,99–106)。在用于纤维素类生物质的分解之前，各个酶的纯化和有效的酶混合物(cocktail)的混合代表在本领域的当今技术中的重要的成本因素。在本领域的现有技术中从获得的产物中回收相应游离的酶也是不可能的。因此，对现成(ready-made)形式的纤维素酶存在需求，其首先使简化的制造和混合方法成为可能，并且其次允许酶在其被使用之后以简单的方式被回收。

因此，本发明的一个问题在于提供具有纤维素酶活性的剂，其中该剂不仅对于底物分子是容易可及的，而且也可以以简单的方式被扩增、回收和再生。这将使数个催化步骤成为可能，而无需重复制造新剂。本发明的另外的问题在于提供在其遗传学、热稳定性、可储存性和稳定性方面呈现有利的特性的剂。

本发明的发明人惊人地发现，通过使用自转运体系统，纤维素酶可在微生物表面表达，并且对于用于分解纤维素和随后分离获得的产物的反应条件是足够稳定的。还惊人地发现，在其表面携带相应纤维素酶的微生物可在不同条件下的各种溶液和缓冲液中长期被培养并保持稳定。

自展示代表用于在细菌表面展示重组蛋白质的精妙的工具。此表达系统基于属于V型分泌系统的自转运体的蛋白家族的分泌机制。