[发明专利]一种联产香叶醇和橙花醇的基因工程菌及其构建方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种联产香叶醇和橙花醇的基因工程菌及其构建方法和应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

香叶醇（反-3，7-甲基-2，6-辛二烯-1-醇，Geraniol，又称牻牛儿醇）及其同分异构体橙花醇（顺-3,7-二甲基-2,6-辛二烯醇，nerol）是一种非环单萜醇类化合物，是玫瑰油、马丁香油和香茅油等香精油的主要成分之一。香叶醇和橙花醇及其酯可用于香精和食用香精，是玫瑰系香精的主剂，还可广泛应用于药物、烟草、食品配料。此外，还可用作天然低毒防虫剂，一类新型的化学防癌制剂。目前橙花醇的全球年需求量在5000吨左右，其中我国的需求量也不低于500吨，而全世界的生产能力只有3000吨左右。

香叶醇和橙花醇天然存在于天竺葵、芸香草、香茅、玫瑰花等50多种植物中。从天然植物中提取出挥发油，仍是市场上的主要来源。但是，由于人工培植受气候影响较大，且随着人力成本的上升，天然香叶醇的数量和成本难以稳定，供应不能得到保证。

工业上生产香叶醇和橙花醇是以月桂烯为原料，月桂烯的一级氯化物与乙酸钠共热，得香叶醇和橙花醇的乙酸酯混合物。然后将此粗酯皂化，再蒸馏得约含60%牻牛儿醇和40%橙花醇的混合物，仔细分馏可得高品级的香叶醇。黄宇平等以芳樟醇为原料，合成出香叶醇和橙花醇。以柠檬醛为原料制备橙花醇香叶醇的合成方法已有许多报道，例如催化氢化法，醇铝法，硼氢化钠法。尹显洪对硼氢化钠法进行改进研究，以水和苯作混合溶剂，替代纯有机溶剂。采用相转移催化方法，提高反应速率。但是，化学法存在环境污染、条件苛刻等问题，且合成的产品杂质多，影响了香叶醇的品质及下游应用。

发明内容

本发明要解决的问题是提供一种以葡萄糖为底物合成香叶醇和橙花醇的基因工程菌。

所述基因工程菌是在能够表达香叶基焦磷酸的微生物中导入了香叶醇合成酶基因或磷酸酶基因得到的基因工程菌。

所述微生物为常用于分子生物学改造的微生物，优选大肠杆菌。

所述基因工程菌共表达了乙酰辅酶A酰基转移酶/羟甲基戊二酰辅酶A还原酶、3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A合酶、甲羟戊酸激酶、甲羟戊酸-5-磷酸激酶、甲羟戊酸-5-二磷酸脱羧酶、异戊烯焦磷酸异构酶、香叶酯二磷酸合成酶，以及香叶醇合成酶或磷酸酶。

所述乙酰辅酶A酰基转移酶/羟甲基戊二酰辅酶A还原酶来源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，或细菌，或其它生物体，优选粪肠球菌（Enterococcusfaecalis）。

所述3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A合酶来源于：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，或细菌，或其它生物体，优选粪肠球菌（Enterococcusfaecalis）。

所述甲羟戊酸激酶来源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，或细菌，或其它生物体，优选酿酒酵母。

所述甲羟戊酸-5-磷酸激酶来源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，或细菌，或其它生物体，优选酿酒酵母。

所述甲羟戊酸-5-二磷酸脱羧酶来源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，或细菌，或其它生物体，优选酿酒酵母。

所述异戊烯焦磷酸异构酶来源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，或细菌，或其它生物体，优选酿酒酵母。

所述香叶酯二磷酸合成酶来源于大肠杆菌(Escherichia coli)，或北美冷杉(Abiesgrandis)其它生物体，优选北美冷杉。

所述香叶醇合成酶来源于甜罗勒(Sweet Basil)，或细毛樟(Cinnamomum tenuipilum)，或其它生物体。优选来源于甜罗勒的香叶醇合成酶，其核苷酸序列如GenBank:AY362553.1所示。