[发明专利]一种猪HEV总抗体ELISA检测试剂盒的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于戊型肝炎病毒的检测技术领域，尤其涉及一种猪HEV总抗体ELISA检测试剂盒的制备方法。

背景技术

戊型肝炎（Hepatitis E）是一种由戊型肝炎病毒（Hepatitis E virus，HEV）引起的经消化道传播的人畜共患传染病。该病在青少年中容易发展为暴发性肝炎，可以导致孕妇流产，病死率高达21%。HEV分布广泛，危害严重。

世界各国相继都有猪源HEV相关的报道，与人类HEV序列比对结果发现两者具有极高的同源性，随后又发现提取的RNA病毒可以感染黑猩猩和恒河猴。随后，相继的实验结果表明猪戊型肝炎是一种人畜共患病，猪作为戊型肝炎病毒的主要自然宿主，HEV平均感染率最高可达83.4%，许多携带戊肝病毒的猪群并不表现发病状态(Meng X J et al.，1997)。猪是人类重要的肉食来源，同时作为人类器官移植的主要供体，有效控制戊型肝炎就必须切断猪-人传播途径。这就凸现了猪戊型肝炎病毒的检测诊断的意义。

由于嗜肝病毒本身的生物学特性，目前还没有成熟的体外细胞培养系统可以大量增殖病毒粒子，加上病毒本身对外界环境抵抗力弱，至今还没有开发出令人满意的猪戊型肝炎诊断试剂盒和疫苗。

HEV为RNA病毒，对HEVRNA的检测主要为采用PCR方法进行，但是由于各地所用引物不尽相同，检测结果不尽人意；而且由于病毒RNA在血液中存在时间较短，病毒含量低，RNA易于降解等因素，使得检测HEV RNA存在一定的困难。因此，目前对HEV的诊断主要通过检测血清中抗HEV IgG和抗HEV IgM来进行诊断。

免疫学检测方法特异性高，敏感性强，简便快速等优点，已成为HEV血清学检测最常用的方法，现在随着生物学技术的不断发展，可以采用基因工程方法表达相关蛋白来建立一系列血清学检测方法。本发明采用双抗原夹心法建立猪戊型肝炎病毒总抗体ELISA检测试剂盒，旨在快速准确高效的对猪血清中戊型肝炎病毒总抗体进行检测，从而建立一种灵敏度好、特异性高的免疫学检测方法用于检测和评估猪群的HEV抗体水平，对于猪群戊型肝炎病毒的临床诊断和预防控制具有重要意义。

目前，市场上戊型肝炎病毒的检测主要采用血清学ELISA检测法，此产品主要应用于人血清抗体的检测，还没有相关产品用于猪HEV抗体的检测，猪作为戊型肝炎病毒的主要自然宿主，由于缺乏相关可行的检测产品，暂时也没有猪群HEV抗体水平的检测报告。猪源HEV与人类HEV序列具有极高的同源性，且其RNA病毒还可以感染黑猩猩和恒河猴等其它动物，为了弥补这一技术空白，开发了猪源HEV总抗体ELISA检测方法，克服了现有试剂盒只能特异性检测人戊型肝炎病毒的不足，该产品为第一个专门用于检测动物戊型肝炎总抗体的免疫产品系列。

发明内容

本发明在于提供一种猪HEV总抗体ELISA检测试剂盒的制备方法，旨在解决现有戊型肝炎病毒的试剂盒只能特异性检测人戊型肝炎病毒，而不能检测猪源的戊型肝炎病毒的问题。

本发明是这样实现的，一种猪HEV总抗体ELISA检测试剂盒的制备方法，该猪HEV总抗体ELISA检测试剂盒的制备方法包括以下步骤：

第一步，HEV包被抗原的制备：

首先PCR扩增猪源swCH189株HEV ORF2基因部分的两个片段，上下游引物分别带有BamH Ⅰ和Not Ⅰ酶切位点；

FS为S片段上游引物，带有BamH Ⅰ酶切位点，RS为片段下游引物，带有Not Ⅰ酶切位点；FP12为P12片段上游引物，带有BamH Ⅰ酶切位点，RP12为片段下游引物，带有NotⅠ酶切位点；

PCR片段扩增后回收，采用BamH Ⅰ和Not Ⅰ双酶切，连接到pMD18-T载体，将连接产物转化大肠杆菌DH5α，挑取转化子，小提质粒，用BamH Ⅰ和Not Ⅰ酶切鉴定，鉴定阳性克隆分别命名为T-S和T-P12；

将pET32a（+）与鉴定的克隆质粒分别以BamH Ⅰ/Not Ⅰ进行消化，进行琼脂糖电泳，胶回收目的片段后进行连接，构建可在大肠杆菌中表达的重组质粒，命名pET-S和pET-P12，将连接产物转化大肠杆菌DH5α，挑取转化子，小提质粒，用BamH Ⅰ和Not Ⅰ限制性内切酶进行酶切鉴定；