[发明专利]一种猪HEV总抗体ELISA检测试剂盒的制备方法

权利要求书

1.一种猪HEV总抗体ELISA检测试剂盒的制备方法，其特征在于，该猪HEV总抗体ELISA检测试剂盒的制备方法包括以下步骤：

第一步，HEV包被抗原的制备：

首先PCR扩增猪源swCH189株HEV ORF2基因部分的两个片段，上下游引物分别带有BamH Ⅰ和Not Ⅰ酶切位点；

FS为S片段上游引物，带有BamH Ⅰ酶切位点，RS为片段下游引物，带有Not Ⅰ酶切位点；FP12为P12片段上游引物，带有BamH Ⅰ酶切位点，RP12为片段下游引物，带有Not Ⅰ酶切位点；

PCR片段扩增后回收，采用BamH Ⅰ和Not Ⅰ双酶切，连接到pMD18-T载体，将连接产物转化大肠杆菌DH5α，挑取转化子，小提质粒，用BamH Ⅰ和Not Ⅰ酶切鉴定，鉴定阳性克隆分别命名为T-S和T-P12；

将pET32a（+）与鉴定的克隆质粒分别以BamH Ⅰ/Not Ⅰ进行消化，进行琼脂糖电泳，胶回收目的片段后进行连接，构建可在大肠杆菌中表达的重组质粒，命名pET-S和pET-P12，将连接产物转化大肠杆菌DH5α，挑取转化子，小提质粒，用BamH Ⅰ和Not Ⅰ限制性内切酶进行酶切鉴定；

阳性重组质粒pET-S和pET-P12转化Rossetta(DE3)感受态细胞，挑选单克隆菌落于氨苄西林钠LB培养液中培养10h，菌液以1:100的比例加入到1L含100μg/ml氨苄西林钠的LB培养基37℃振荡培养至OD600=0.8，加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG，25℃诱导5h，4℃6000r/min离心15分钟收集菌体，菌体采用20ml1%TritonX-100的PBS悬浮，超声波破碎，4℃12000r/min离心30分钟，分别取上清和沉淀进行SDS-PAGE，分析确定表达产物在大肠杆菌的存在形式，结果发现重组蛋白以包涵体的形式存在；

目的蛋白进行SDS-PAGE，条带与预期大小相一致，命名为S蛋白，纯化后的S蛋白为包被抗原；

第二步，HEV标记抗原的制备：

将阳性克隆pET-P12于Amp+LB培养液中培养10h，菌液以1:100的比例加入到1L含100μg/ml氨苄西林钠的LB培养基37℃振荡培养至OD600=0.8，加入终浓度为1mmol/L的IPTG，25℃诱导5h，4℃6000r/min离心15分钟收集菌体，菌体采用20ml1%Triton X-100的PBS悬浮，超声波破碎，4℃12000r/min离心30分钟，分别取上清和沉淀进行SDS-PAGE，确定表达产物以包涵体的形式存在于沉淀，进行蛋白的纯化，纯化得到的蛋白命名为P12蛋白，为标记蛋白；

第三步，HEV标记抗原-HRP标记物的制备，具体包括：

步骤一，HEV标记抗原和HRP的偶联采用NaIO₄氧化法，首先将纯化蛋白P12于PBS溶液中4℃透析过夜；

步骤二，紫外分光光度计测定纯化蛋白浓度；

步骤三，分析天平秤取HRP10mg溶于2ml超纯水中制备终浓度为5mg/ml的HRP溶液，分析天平秤取NaIO₄，溶于超纯水中制备终浓度为20mg/ml的NaIO₄溶液备用；

步骤四，缓慢滴加225μl NaIO₄溶液于2ml HRP溶液中，室温下避光静置20分钟；

步骤五，加入20μl乙二醇于HRP混合溶液中，之后室温下静置30分钟；

步骤六，取1ml2.1mg/ml的标记蛋白P12缓慢逐滴加入到活化好的HRP溶液中；

步骤七，然后将P12蛋白-HRP结合物分别于50mM CB pH9.6的溶液中4℃避光透析2.5个小时；

步骤八，分析天平称量NaBH4溶于水中，制备终浓度为4mg/ml的NaBH₄溶液；

步骤九，将透析袋取出，加入162μl的NaBH₄溶液；

步骤十，室温下在摇床上轻轻震动2个小时；

步骤十一，标记物在PBS溶液中4℃透析过夜；

步骤十二，透析结束后1：1比例加入甘油，-20度保存，此标记物下文称为HRP-P12；

第四步，采用碳酸盐缓冲液以一定比例将S抗原稀释，100μl/孔加入到酶标板，4℃包被过夜，次日采用PBST(10mM PB，150mM NaCl，0.05%Tween-20，pH7.4)洗涤液洗板三次，最后一次拍干，150μl/孔加入含30%新生牛血清，8%蔗糖，5%牛血清白蛋白，150mM NaCl的ρΗ7.4，10mM PB封闭液，4℃封闭12小时，次日甩掉孔内液体，拍干，置室温20-25℃、湿度20%-25%、有通风设备的干燥房间内风干过夜，封装于加有干燥剂的铝膜袋中，包被完毕。