[发明专利]一种猪肠道组织中白细胞介素17荧光定量PCR检测方法

说明书

本发明涉及一种猪肠道组织中白细胞介素17荧光定量PCR检测方法。该方法包括设计特异性荧光定量PCR引物，建立荧光定量PCR反应体系和反应程序，制备含有目的片段IL‑17的质粒作为标准质粒绘制标准曲线，最后待测样品的目的基因和内参基因GAPDH同时扩增，根据相对定量△△C_T方法检测基因的表达量。本发明由于利用了荧光定量PCR具有灵敏度高，特异性强，无污染且实时、准确、快速的特点，为检测猪肠道部位的IL‑17表达水平，从而辅助评价动物肠道部位免疫状态或疾病过程提供了一个实用方法。

技术领域

本发明涉及一种猪肠道组织中白细胞介素17荧光定量PCR检测方法，属于生物技术领域。

背景技术

白细胞介素17（IL-17）是一种重要的促炎症细胞因子，由辅助性T细胞（Th17）及先天性免疫细胞等分泌，在多种炎性反应及自身免疫性疾病病理过程中发挥关键作用。

在动物体内微环境作用下，幼稚型T细胞可分化为Th1，Th2，Th17，Th22，滤泡辅助性T细胞和Treg细胞亚型。其中Th17细胞是一种能够分泌IL17细胞因子的独特亚型。IL-17是一种由Th17细胞，自然杀伤性T细胞，γσT细胞等表达的促炎性细胞因子，在自身免疫性疾病及多种炎性反应中发挥关键作用。人类IL-17相关研究表明，该因子是联系天性免疫反应与获得性免疫反应重要桥梁，并对二者均有有效地促进作用。猪的IL-17因子于2004年由Katoh等人克隆并描述后，也成为猪免疫学研究检测的重要指标之一。猪的消化道是营养学与病理学研究的重要组织部位，对猪肠道部位IL-17进行精确定量可有助于我们对被检猪只免疫状态及其疾病过程分析提供有力的理论数据支持。

目前，检测细胞因子的常用方法主要分为从蛋白水平和基因水平检测两种。蛋白水平的检测包括：（1）流式细胞术，主要是利用荧光标记的抗细胞因子抗体标记表达该细胞因子的细胞，再通过流式细胞仪用单细胞分析的方式从蛋白水平检测。此方法虽特异性强，但操作过程繁琐代价较高，难于推广。（2）Western-blot方法，即通过酶标的抗细胞因子抗体与固定到变性凝胶上的蛋白样品进行杂交，该方法多用于定性检测，用于定量时操作水平要求较高，精确度较低。（3）ELISA方法，该方法主要用于检测分泌型的细胞因子，例如血清中的蛋白水平，难以反应细胞内的情况。基因水平的检测包括普通聚合酶链式反应（PCR）技术与实时荧光定量PCR技术。常规PCR由于灵敏度较低也仅常用于定性检测，而荧光定量PCR具有灵敏度高，且实时、定量、快速等特点。常用荧光定量PCR技术又分为荧光探针法（TaqMan探针技术）与荧光染料法（SYBRGreen法）。与TaqMan技术相比，SYBR Green法实验设计简单，无需设计多个探针即可快速检测多个基因，初始成本更低，通用性好。然而，目前关于用染料法检测猪肠道的白细胞介素-17的荧光定量的检测方法却鲜有报道。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供一种猪肠道组织中白细胞介素17转录本荧光定量PCR检测方法。

首先，本发明提供一种白细胞介素17转录本荧光定量PCR引物，正向引物具有SEQID No.1所示的序列，反向引物具有SEQ IDNo.2所示的序列。

进一步地，本发明还提供一种猪肠道组织中白细胞介素17转录本荧光定量PCR检测方法，其为将肠道样品制备成cDNA，用所述的引物进行荧光定量PCR反应。

在本发明一个具体实施方案中，所述猪肠道组织中IL-17转录本荧光定量PCR检测方法包括如下步骤：首先设计前述的特异性荧光定量引物，然后建立实时定量PCR反应体系和反应程序，制备含有目的片段的质粒作为标准质粒绘制标准曲线，最后将待测样品的目的基因IL-17与内参基因GAPDH同时扩增，根据相对定量△△C_T方法确定目的基因的表达变化。

本发明检测方法中，每20μl的荧光定量PCR反应体系如下：10μl荧光定量PCR预混液，5μmol/L正向引物、反向引物各0.5μl，2μl标准质粒或样本cDNA，用水补足至20μl。