[发明专利]转基因水稻科丰2号外源插入基因和侧翼水稻序列的连接区序列及应用

说明书

技术领域

本发明涉及转基因水稻的侧翼序列，尤其涉及转基因水稻科丰2号插入基因载体和侧翼水稻序列的连接区序列及其应用，属于转基因水稻品系特异性的检测领域。

背景技术

随着转基因植物的广泛种植，转基因食品的安全性问题也引起人们极大的关注，已有30多个国家相继实施转基因产品标识制度，包括中国。转基因标识制度的实施依赖于对转基因植物及其加工产品的成分检测。PCR技术是目前国内外检测转基因产品中应用最广泛的方法。在应用这种技术进行转基因作物定性检测时，根据其特异性，将其分为筛选检测法、基因特异性方法、构建特异性方法和品系特异性方法。品系特异性检测是通过检测插入载体与植物基因组的连接区序列实现的，由于每一个转基因植物品系，都具有特异的外源插入载体与植物基因组的连接区序列，和前三种方法比较，品系特异性具有更高的特异性和准确性，最适合做转基因产品检测。

目前，已有部分专利和文献报道了转基因植物的品系特异性检测方法。例如：张大兵等人于2006年建立了转基因MON863玉米的品系特异性检测方法；谢家建等人建立了转基因水稻克螟稻、Bt汕优63、科丰6号和科丰8号等一系列品系特异性检测方法；卢长明等人于2007年建立了一系列转基因油菜的品系特异性检测方法。但是，目前为止，尚未发现任何关于转基因水稻科丰2号的品系特异性PCR检测方法。确定外源插入基因和侧翼水稻序列的连接区序列是建立转基因水稻科丰2号的品系特异性PCR检测方法的前提。

发明内容

本发明的目的之一是获取转基因水稻科丰2号外源插入基因载体和侧翼水稻序列的连接区序列；

本发明的目的之二是将获取转基因水稻科丰2号外源插入基因载体和侧翼水稻序列的连接区序列作为靶基因应用于转基因水稻科丰2号品系特异性的定性检测。

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明根据转基因水稻科丰2号品系中插入的目的基因为SCK基因（SEQ ID No.1）通过Hi-TAIL PCR获得外源插入基因5’端水稻侧翼序列和3’端水稻侧翼序列，最终所获得的含有SCK基因的外源插入基因载体及其两侧5’端和3’端侧翼水稻序列的连接区核苷酸序列为SEQ ID No.2所示；本发明进一步根据科丰2号外源插入载体和5’端水稻侧翼序列形成的5段连接区序列设计了5对转化体引物，这5对转化体引物虽然均能特异性地从科丰2号样品中扩增出特异性片段，但是在华恢1号，抗优97，辽粳371，MON89788，H7-1等水稻品种也均有扩增条带，所以采用这些连接区作为靶基因设计的特异性引物检测的特异性不好。

本发明进一步根据科丰2号外源插入载体和3’端水稻侧翼序列所形成的连接区核苷酸序列（SEQ ID No.13）设计5对转化体特异性引物，5对引物的核苷酸序列分别为SEQ ID No.3-SEQ ID No.12所示，应用常规的PCR反应条件，分别采用5对引物进行PCR扩增，设置2个重复；从扩增结果可见，这5对引物均能特异性地从科丰2号样品中扩增出预期片段，但是用SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示的引物扩增的条带最为清晰；SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示的引物是以SEQ ID No.13所示的外源插入载体和3’端水稻侧翼序列所形成的连接区核苷酸序列为靶基因所设计的一对特异性检测引物，这说明以SEQ ID No.13所示的连接区核苷酸序列能够作为转基因水稻科丰2号品系特异性检测的靶基因，例如，以该靶基因设计检测引物，能够准确的对转基因水稻科丰2号品系特异性进行定性检测。

因此，本发明进一步将所获取的转基因水稻科丰2号外源插入基因和侧翼水稻序列的连接区序列应用于转基因水稻科丰2号的品系特异性的定性检测，包括：（1）提取待检测水稻样品的DNA；（2）以SEQ ID No.2或SEQ ID No.13为靶基因设计特异性检测引物，建立PCR扩增体系并进行PCR扩增；（3）如果从待检测的样品中扩增出预期的特异性条带，则待检测的水稻样品是转基因水稻科丰2号；如果从待检测的样品中未能扩增出预期的特异性条带，则待检测的水稻样品不是转基因水稻科丰2号。

其中，所述的从待检测水稻样品中提取DNA的方法，可以是从植物材料中提取DNA的各种常用方法，例如可以是CTAB法、异硫氰酸胍法或盐酸胍法等各种方法。