[发明专利]密码子优化的MG53蛋白的编码核苷酸序列、其重组体及其应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域/生物医药技术领域。具体而言，本发明涉及密码子优化的MG53蛋白的编码核苷酸序列、含有该序列的重组载体以及宿主细胞。本发明还涉及通过MG53蛋白基因密码子的优化提高蛋白表达量的方法及其在保护心脏、治疗细胞死亡导致的心脏疾病方面上的用途。

背景技术

MG53是骨骼肌特异性蛋白mitsugumin53，简称MG53;或TRIM72。mitsugumin53（MG53），是一种肌肉特异性tripartite motif family(TRIM)家族蛋白（该家族蛋白常含三个特定模序结构，分别称为RING，B-BOX，和卷曲结构域。它们共同作用结合在细胞不再需要的蛋白质上，将这些蛋白带上泛素标记以便降解），也是一种细胞膜修复机制的重要组成部分。

在医学应用方面，MG53治疗由细胞凋亡引起的心脏疾病的功效已被接受并成为业内前沿领域的公知。MG53能够对心脏产生保护作用，也就是说可以通过增加MG53的含量保护心脏损伤。但目前通过已知的人源野生型MG53蛋白表达基因，通过体外真核细胞蛋白表达体系无法获得更高的蛋白产量，进一步降低生产成本，成为该蛋白研究和应用于生物医药领域的瓶颈。

发明内容

本发明提供一种人源MG53基因的密码子优化核苷酸序列，SEQ ID NO:2，即人源野生型MG53的同义突变核苷酸序列（MG53mut），编码相同人源MG53蛋白。人源野生型MG53SEQ ID NO1。

MG53蛋白能够对心脏产生保护作用，也就是说可以通过增加MG53的蛋白含量保护心脏损伤。

但通过大量实验研究表明，通过体外人工表达人源野生型MG53的蛋白，产量一直无法 提高，无法降低生产成本，阻碍这种体外蛋白表达系统进一步应用于生物医药领域和产业化进程。

MG53是TRIM家族（The superfamily of tripartite motif-containing proteins）中新发现的一个蛋白质，与其他家族成员不同，它只在骨骼肌和心肌表达。初期的研究表明，在骨骼肌和心肌中MG53能够作为一种结构蛋白促进细胞膜损伤的修复，同时也能够调节细胞内小泡的转运和骨骼肌细胞再生；另外在心肌中，MG53还通过介导Caveolin-3与PI3K的结合，激活再灌注损伤救援通路（reperfusion injury salvagekinase pathway,RISK pathway），进而在心脏缺血预处理中发挥重要保护功能。本申请发明人通过大量实验摸索后，提出一种密码子优化的MG53基因核苷酸序列，SEQ ID NO:2，将其使用真核细胞表达载体体外表达，同等条件下可以获得比野生型MG53高约30%，成为该核苷酸序列优于人源野生型MG53基因核苷酸序列的重要特征。

本发明还提供了一种密码子优化的MG53核苷酸序列体外蛋白表达方法，该方法在于，根据全基因合成方式合成MG53mut基因，通过分子克隆方式连接于真核表达载体上，转染入真核细胞中通过适当的培养方法来表达MG53蛋白。

在本发明的具体实施例中，所述的该同义突变MG53（MG53mut）体外表达方法的过程为：

（1）全基因合成SEQ ID NO:2所提供的核苷酸序列MG53mut；作为模板，使用DNA聚合酶，用特异性突变引物进行PCR反应扩增，反应产物用琼脂糖凝胶电泳鉴定；

（2）通过分子克隆方式，连入通过转化大肠杆菌感受态细胞TOP10，融解感受态TOP10，加入处理后的PCR产物，冰上孵育，加入LB，孵育，涂氨苄抗性LB平板，培养，挑取平板上的单菌落，DNA测序检测得突变结果为阳性，得到MG53mut表达质粒；

（5）上述MG53mut质粒通过利用ScreenFectA转染细胞方式获得MG53蛋白。

本发明还提供了上述的MG53mut在制备治疗心肌细胞损伤相关疾病的药物中的用途。

上述的MG53突变体的用途，其中所述的治疗心肌细胞损伤的药物还包括治疗/预防心脏缺血、再灌注损伤所致疾病的药物；上述疾病进一步还包括心肌细胞缺损、心肌缺血、心脏缺血/再灌损伤、心肌梗塞、心力衰竭、心律失常、心脏破裂等的药物。

关于MG53在治疗心脏损伤/心肌损伤中的应用，以及其在治疗/预防心脏缺血、再灌注损伤所致疾病中的用途，可参见200910241451.3公开的药学实验部分的实验方法和实验数据。

在心肌细胞中过表达MG53,能对缺氧引起的心肌细胞损伤产生保护作用。