[发明专利]一种植物内生真菌布雷正青霉菌F4a及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体为一种植物内生真菌布雷正青霉菌F4a及其应用。

背景技术

植物内生菌是指一类在其部分或全部生活史中存活于健康植物组织内部，而不使寄主植物表现出明显感染症状(至少暂时没有感染症状)的微生物。在长期的进化过程中与宿主这个其特殊生境形成了特定的互利共生的关系，其生长代谢受宿主、外界环境因子等多方面因素的制约。如今，内生菌所发挥的重要的生理和生态作用及其在农、林业和医药领域中的巨大应用潜力，已逐渐成为国内外研究的热点。因此，丰富多样的植物内生菌已成为在寻找抗肿瘤、抗感染和抗植物病虫害活性物质的重要来源。本发明提供了一株新的植物内生真菌布雷正青霉菌F4a，具有非常强的抗菌和杀虫活性，且其能发酵产生高含量的布雷菲德菌素A(brefeldin A，BFA)

BFA早在1958年由Singleton等从斜卧青霉菌(Penicillium decumbens)中首次分离得到并被命名为ducumbin.直至1971年Weber等确定了该化合物的绝对构型，并使用brefeldin A作为其名称。从而使这一名称沿用至今。BFA是一种包含13元环的大环内酯类抗生素，它能反竞争性抑制蛋白质从内质网中转运至高尔基体，因此具有抗真菌、抗肿瘤、抗病毒、抗线虫等广泛生物学活性。美国国家癌症研究院研究发现BFA具有选择性抑制和杀死人肿瘤细胞活性。BFA通过不依赖于p53凋亡机制诱导人前列腺癌细胞凋亡，因此，BFA是作为诱导不依赖于p53的细胞凋亡的有效的备选化疗药物。Akira等联合使用低剂量BFA提高吉西他滨(gemcitabine)与对人胰腺癌细胞MIA PaCa-2细胞线的作用效果。可见该化合物作为候选抗肿瘤药物、医药和农药中间体和重要的分子工具试剂具有较大的市场需求。BFA结构式如下所示：

BFA因为其多样的生物活性和独特的化学结构引起了合成化学家们的兴趣。但由于其含有多个手性中心，因此化学合成比较复杂且收率较低。同时，由于许多真菌都能发酵产生BFA，包括分枝孢子菌属(Cladosporium)、茎点霉属(Phoma)、拟青霉属(Paecilomyces)、叶点霉属(Phyllosticta)、青霉属(Penicillium)、正青霉属(Eupenicillium)、曲霉属(Aspergillus)等等。因此微生物发酵产生BFA成为一种有效的方式。但是目前报道的微生物发酵产BFA的产量较低。如Howard等发明的美国专利U.S.3896002公开了Phyllosticta medicaginis发酵BFA的产量为300mg/L。刘万云报道青霉菌Penicillium sp.SHZK-15经优化发酵条件后产BFA为151.6mg/L。发明人郑裕国等的中国专利CN 101445784A公开了利用低能离子注入技术诱变获得的布雷正青霉变种ZJB082702能发酵产生高达943.8mg/L的BFA。2012年王亚军等进一步对布雷正青霉变种ZJB082702的发酵条件进行优化，最终使BFA的产量达1304.7 mg/L。

发明内容

本发明目的在于提供一种植物内生真菌布雷正青霉菌F4a及其应用。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种植物内生真菌布雷正青霉菌F4a，植物内生真菌为布雷正青霉菌F4a(Eupenicillium brefeldianum F4a)，于2012年12月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC M 2012531。

植物内生真菌布雷正青霉菌F4a的应用，其特征：利用所述植物内生真菌布雷正青霉菌F4a用以制备布雷菲德菌素A。

利用植物内生真菌布雷正青霉菌F4a制备布雷菲德菌素A的方法，

1)将布雷正青霉菌F4a发酵种子液按照体积比1:10-1:20接种于PSB发酵培养基，28℃培养7-15d；

2)将上述所得发酵液采用4-6层纱布过滤，固液分离得到上清液及菌丝体；过滤上清液采用HP20大孔吸附树脂固相萃取，用70-100％乙醇洗脱获得粗提物；菌丝体经丙酮提取得提取物；合并两部分提取物减压浓缩后进一步经MeOH精制得到BFA含量超过50-65％的粗提取物；

3)将上述粗提取物用减压快速硅胶柱色谱法分离，使用49:1-0:10(v/v)二氯甲烷/甲醇溶剂系统进行梯度洗脱，收集体积百分比为47:3-44:6的二氯甲烷/甲醇洗脱液，即得纯度为90-99％的布雷菲德菌素A；