[发明专利]一种与小麦叶锈病抗性相关的类甜蛋白及其编码基因与应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种与小麦叶锈病抗性相关的类甜蛋白及其编码基因与应用。 

背景技术

小麦(Triticum aestivum Linn.)作为重要的粮食作物，在食品工业和农业生产中占有重要地位(曹亚萍, 2008)。小麦叶锈病在中国各大产麦区均普遍发生，是影响小麦产量和品质的重要病害之一(Bolton et al., 2008)。近年植物基因工程技术发展迅速，以抗病基因和各类抗病相关基因的克隆和转化为核心的分子育种途径已经成为育种的新方向。 

病程相关蛋白是指由寄主植物编码，在病理或病理相关环境下诱导产生的一类蛋白(Van et al.，1999)。按植物来源、电泳迁移率(分子量)、血清学关系以及氨基酸序列的同源性为标准的分类体系，可将PRP分为17个家族，即PR1到PR17(Van Loon et al., 2006)。其中，PR5蛋白也被称为类甜蛋白(Thaumatin-like Protein, TLP)，和非洲植物西非竹竽(Thaumatococcus danielli L.)的甜蛋白在氨基酸序列上有很高的同源性(Pierpoint et al., 1990)，但两者的理化性质不相同，甜蛋白具有甜味无抗真菌活性，类甜蛋白无甜味具有抗真菌活性(Ho et al., 2007)；目前已经从很多植物中发现了 PR5 蛋白，例如大豆，玉米，杨树等，大多数 PR5 蛋白分子量在 24～25KD(姜晓玲等, 2012)，能诱导植物的细胞程序性死亡(programmed cell death, PCD)，增加植物抗逆境能力(D’angeli et al., 2007；高庆华等, 2013)。植物基因组中的PR5基因以基因家族的形式出现，分布于不同的细胞或组织中。PR5蛋白抗真菌活性非常显著(姜晓玲等,2012)，参与超敏反应（HR)和植物系统获得性反应（SAR)，在植物抵抗生物和非生物的胁迫中扮演着非常重要的作用。 

由于小麦基因组相对庞大（1.6×10⁹ bp），且结构复杂，直接从中克隆的防卫基因数量较少，这些因素很大程度地限制了小麦抗叶锈病机制的研究和抗性资源的储备利用。在小麦叶锈菌与寄主互作中PRs基因分子水平研究报道还较少，对小麦中PR5基因的表达模式进行研究具有重要意义，将明确该基因在小麦抗叶锈病防御反应中发挥的作用，为深入揭示PR5蛋白参与小麦与叶锈菌互作的分子机制和小麦抗叶锈病分子育种提供基础资料。 

发明内容

本发明要解决的技术问题是在优良的小麦抗叶锈病近等基因系材料TcLr19中分离一类病程相关蛋白基因——类甜蛋白基因，明确及表达模式及其与小麦抗叶锈病的相关性。 

为解决上述技术问题，本发明所用引物序列包括TcLr19PR5_F和TcLr19PR5_R，由序列表中上游序列（29个碱基）和下游序列（33个碱基）组成，见表1。 

  

表1用于扩增类甜蛋白基因的引物上下游序列

本发明利用RT-PCR和电子克隆技术获得一个小麦类甜蛋白类基因TcLr19PR5。

本发明提供了小麦类甜蛋白基因克隆所用引物序列及PCR反应条件。 

本发明明确了获得的类甜蛋白基因的结构特征和时空表达模式。 

本发明应用的具体方法为：以小麦cDNA和基因组DNA为模板，分别在引物TcLr19PR5_F和TcLr19PR5_R的引导下进行PCR扩增，再对扩增产物进行检测和测序，利用电子克隆技术获得类甜蛋白基因序列全长，并用PCR方法进行验证；同时利用实时荧光定量PCR分析叶锈菌诱导后不同时间点该基因在非亲和组合和亲和组合中的表达模式，验证获得的基因与小麦叶锈病抗性的相关性。 

本发明应用中所述的PCR扩增： 

25 μl PCR反应体系为：100 ng模板cDNA或gDNA， 10μmol/L 引物 1μL， 10 mmol/L dNTP  0.5μL，1U Taq DNA聚合酶 0.3μL，10×PCR缓冲液2.5μL，加入灭菌ddH₂O至25μL。

PCR反应程序为：94℃预变性1 min；94℃变性30 s，62℃退火1 min，72℃延伸 2 min，35个循环；72℃延伸10 min。 

PCR 扩增产物经胶回收与PGM-T vector连接转化至大肠杆菌DH5α，利用菌落PCR扩增辅以蓝白斑筛选鉴定阳性克隆，将阳性克隆单菌落摇菌送至上海生工公司测序。