[发明专利]基于纳米磁珠的核酸提取纯化方法及试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及磁珠法提取纯化核酸领域，尤其是涉及一种基于纳米磁珠的核酸提取纯化方法及试剂盒。

背景技术

核酸包括脱氧核糖核酸(RNA)和核糖核酸(DNA)两类，己知核酸是一切生物体的遗传物质，在细胞主要存在于细胞核内，在病毒存在于病毒衣壳内。目前，在生物医学的各个领域都离不开核酸的提取和纯化，应用生物纳米材料，快速、高通量分离纯化得到高纯度完整的目的核酸DNA/RNA是生物学科的基础。

正因为如此，核酸提取方法多种多样，如酚/氯仿等有机溶剂抽提法、螯合树脂法、玻璃粉吸附法，当前主流的硅胶膜吸附柱法都因为有机溶剂对人体的伤害、操作繁琐或提取的核酸DNA/RNA浓度纯度低、实现自动化困难、单位时间通量低等诸多原因而成为生物学高速发展的瓶颈。

纳米磁珠法在外加磁力的作用下，可快速分离纯化核酸DNA/RNA，因安全并易于实现自动化而迅速发展。纳米磁珠核酸提取方法是指以超顺磁性氧化硅纳米磁性微球(以下简称磁珠)为载体，通过磁珠在高盐、低PH溶液中吸附核酸，而在低盐溶液中将核酸从磁珠表面脱离的原理进行核酸提取的方法，通常使用的纳米级磁珠的直径在100nm～800nm之间。由于磁珠的以下特点，使得磁珠法核酸提取方法非常适用于自动化应用。

纳米磁珠是由四氧化三铁或三氧化二铁等磁性微球与各种含活性功能基团的二氧化硅等材料复合而成的具有一定磁性及特殊表面结构的球形微粒。通过聚合作用给磁性微球表面增添不同功能基团如-COOH、-OH等，也可共价结合酶、细胞、抗体等生物活性物质，磁珠便被赋予了多种活性功能，即形成多种性质磁珠。对比普通颗粒材料，球形磁珠具有很好的表面体积效应比，选择性吸附能力大，吸附平衡时间短。四氧化三铁或三氧化二铁晶体的粒径小于一定值时，磁珠便具有了很好的瞬时磁响应性，也就是我们常说的超顺磁性，即可避免发生中粒子那样的磁性团聚；因为具有超顺磁性，磁珠可在外加磁场的作用下地被定位、导向和分离。

现有的磁珠提取法需要依赖于蛋白酶K，且提取步骤较复杂，所以所需的提取时间就会相对较长，另外提取出的样品也存在纯度不太高的问题，因此提纯后的样品不能完全满足后续的实验要求。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种基于纳米磁珠的核酸提取纯化方法及试剂盒，以实现快速、高通量、自动化地提取纯化核酸DNA/RNA。

为实现上述目的，本发明提出如下技术方案：基于纳米磁珠的核酸提取纯化方法，包括以下步骤：

1)在生物样品中加入裂解缓冲液，使样品中细胞、细胞核破裂，核酸DNA/RNA与核蛋白分离，核蛋白变形沉淀，裂解分离出所述生物样品中的核酸DNA/RNA，所述核酸DNA/RNA与所述裂解缓冲液中的纳米磁珠结合，在外部磁场作用下，纳米磁珠聚集，形成磁珠-核酸复合物；

2)向所述磁珠-核酸复合物中加入洗涤缓冲液，洗涤去除磁珠-核酸复合物上的杂质，在外部磁场作用下，纳米磁珠聚集，收集洗涤后的磁珠-核酸复合物；

3)向所述洗涤后的磁珠-核酸复合物中加入洗脱缓冲液，将结合在纳米磁珠上的核酸DNA/RNA洗脱下来回收，即得到纯化的核酸DNA/RNA。

优选地，所述裂解缓冲液包括：碘化钠1.5～3M，盐酸胍2～3M，EDTA1～10mM，Tween-203％，纳米磁珠8％，SDS2％，异丙醇35％，所述裂解缓冲液的PH值＝7.4；

所述洗涤缓冲液包括：EDTA1～10mM，Tris-cl150mM，乙醇75％，所述洗涤缓冲液的PH值＝6.4；

所述洗脱缓冲液采用1mM氢氧化钠液。

所述生物样品包括有细胞液体样品和无细胞液体样品，所述有细胞液体样品包括细胞、全血、动物组织匀浆液，所述无细胞液体样品包括血清、血浆、组织提取液、拭子洗液、尿液、病毒培养液。

所述纳米磁珠为超顺磁性氧化硅纳米磁性微珠，直径为100～800nm，具有核壳结构，即超顺磁性核心及氧化硅外壳。

本发明还提供了一种基于纳米磁珠的核酸提取纯化试剂盒，所述试剂盒中的组分包括裂解缓冲液、洗涤缓冲液和洗脱缓冲液，所述裂解缓冲液包括：碘化钠1.5～3M，盐酸胍2～3M，EDTA1～10mM，Tween-203％，纳米磁珠8％，SDS2％，异丙醇35％，所述裂解缓冲液的PH值＝7.4，所述异丙醇增强了裂解缓冲液中高浓度盐(主要是盐酸胍、碘化钠)主导的纳米磁珠吸附核酸的作用，盐酸胍、碘化钠不但有促进纳米磁珠和核酸结合的作用，还有解离核酸DNA/RNA和核蛋白的作用。