[发明专利]一种基于纳米金的水中病原微生物检测方法

说明书

技术领域

本发明属于纳米生物技术检测领域，具体涉及一种使用纳米金粒粒子溶液的颜色为检测信号，在体系中将水中病原微生物引物作为纳米金粒子稳定剂的检测比色方法。 

背景技术

众所周知，微生物污染是饮用水最常见的健康风险之一。目前，饮用水中发现的病原微生物种类已超过140种，它们对人类健康有着严重的威胁。根据世界卫生组织（WHO）的数据，每年有400万以上的儿童死于水传疾病（World Health Organization, 2011）。我国在近10年间发生的271起饮用水突发污染公共事件中，微生物污染案例占据主导，造成3万余人罹患疾病。对水传病原微生物进行准确检测，是保障水质安全的必要手段。 

目前日常的水质微生物学检测主要采用基于培养的平皿计数法、多管发酵法（GB/T 5750，2006）进行，由于环境中大部分微生物处于有活性但无法培养（viable but non-culture, VBNC）的状态，这些传统方法往往会低估或者漏查病原微生物的数量或种类。另外，培养法虽然对设备和技术条件要求不高，但操作繁琐且耗时较长，在目前水源水和饮用水污染事故发生较为频繁的情况下，无法满足现场或应急检测快速定性的要求。而以定量PCR技术为代表的新型分子生物学技术可以通过标记有放射性、荧光和化学发光物质的探针与靶序列的杂交实现对水中可培养和不可培养的病原微生物的快速检测，但其设备和试剂成本较高，且标记物质对人体往往具有一定的毒性，本身具有一定的污染风险。 

纳米金粒子（AuNPs）具有良好的生物相容性且无毒副作用，在生命科学，材料科学以及临床医学等领域均有广泛应用。另外，分散在溶液中的纳米金粒子重新聚集会产生肉眼可见的明显颜色变化，是理想的颜色信号元件。 

现有技术未公开不修饰的纳米金对水中病原微生物检测的技术方案。 

发明内容

本发明的目的是提出了一种基于纳米金粒子的水中病原微生物检测方法。此发明首次利用不修饰的纳米金粒子检测水中病原微生物种类，具体使用待检测病原微生物特殊引物（探针）作为纳米金粒子的稳定剂，通过其含量变化导致纳米金粒子稳定性变化，最终造成反应体系的颜色和吸光度值发生变化，纳米金粒子作为颜色信号元件。 

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现： 

一种利用无基团修饰的纳米金粒子检测水中病原微生物的比色法。使用待检测病原微生物特殊引物（探针）作为稳定剂，纳米金粒子作为颜色信号元件。

更确切地，本发明所述的方法具体包括如下步骤： 

（1）采用柠檬酸钠还原氯金酸方法制备纳米金粒子溶液，

（2）采用富集方法获得水样样品，

（3）采用裂解方法获得水样DNA粗提产物，

（4）采用特定的条件对水样样品进行PCR扩增反应，

（5）采用特定的体积混合步骤（1）和（4）中溶液，并加入PBS缓冲液，观察溶液颜色变化或对溶液进行检测，得到相应的紫外可见光谱。

根据权利要求2所述的利用无基团修饰的纳米金粒子检测水中病原微生物的比色法，其特征在于，所述步骤（1）中柠檬酸钠还原法是利用1%的氯金酸溶液还原制备得体系为50ml纳米金粒子溶液，纳米金粒子粒径约为15nm。 

根据权利要求2所述的利用无基团修饰的纳米金粒子检测水中病原微生物的比色法，其特征在于，所述步骤（2）中富集方法为滤膜截留水样中的微生物得到水样样品，滤膜孔径为0.22-0.45μm，材质为混合纤维素酯膜，优选0.22μm。 

根据权利要求2所述的利用无基团修饰的纳米金粒子检测水中病原微生物的比色法，其特征在于，所述步骤（3）中裂解液成分为浓度0.1-1%的十二烷基磺酸钠（SDS），优选0.5%。 

根据权利要求2所述的利用无基团修饰的纳米金粒子检测水中病原微生物的比色法，其特征在于，步骤（4）中PCR扩增条件统一设定为95°C，预变性5min；95°C，45s，55.5°C，45s，72°C，45s，进行35个循环反应；72°C，10min。 

根据权利要求2所述的利用无基团修饰的纳米金粒子检测水中病原微生物的比色法，其特征在于，步骤（5）中选取PCR产物体系为10μl，纳米金粒子溶液体系为90μl，PBS缓冲溶液的终浓度为2.5mM-12.5mM，优选2.5mM；纳米金粒子溶液与PBS缓冲溶液体积比为1:10-1:2，优选1:3（30μl : 90μl）。