[发明专利]一种血液中亚硝酸盐的检测方法

说明书

技术领域

本发明属于体内药物检测技术领域，具体涉及一种血液亚硝酸盐的检测方法。

背景技术

一氧化氮（NO）是一种对心血管、内分泌、神经和免疫系统起调控作用生物信号分子，发展一种血液及体液中NO简单、准确的检测方法对其在临床、药物中的作用是非常重要的。NO具有结构简单、低分子量、高亲脂性及自由基等特点，在体内极不稳定，有很短半衰期，仅有几秒钟，易形成亚硝酸盐和硝酸盐。直接进行NO检测是困难的，作为相对稳定的NO代谢产物，亚硝酸盐（NO₂^-）在最近10年成为世界医学界的热点，通过测定血液及体液中的NO₂^-的含量来反映体内NO含量和作为反应多项身体机能的重要指标或疾病诊断。

目前亚硝酸盐检测亚硝酸盐的测定方法有离子色谱法、分光光度法、荧光光度法、高效液相色谱法等。食品中亚硝酸盐一是含量相对高，二是基本没有盐的干扰，离子色谱法及光度法都是较适合的检测方法，而体内血液或体液中亚硝酸盐含量低，样品量少，基体干扰严重。目前检测通常用Griess检测试剂盒，由于受到检测灵敏度的限制及基体干扰，通常很难检测出血液或体液中亚硝酸盐，其灵敏度通常只能达到1µg/mg。研究小组之前已利用高效液相色谱(HPLC)对血液尿液及组织中硝酸盐与亚硝酸盐检测进行了研究，取得了不错的效果，申请了发明专利（201310129291.X），同时还将亚硝酸盐与Griess试剂反应，经浊点萃取（CPE）进行分离、富集，直接目视比色，进行血液尿液中亚硝酸盐简单、快速检测，申请了发明专利（201310274145.6、201310428467.1）。进一步研究发现，临床上更需要一种能定量、准确、方便的检测血液中亚硝酸盐方法，由于临床上血液亚硝酸盐检测具有样品量少、基体干扰大，样本量大等特点，若用现行的光度法检测需要较多样品量，否则要进一步稀释，降低检测灵敏度。本发明利用酶标仪替代通用的光度计，一是检测波长通用，一般酶标仪都具此波长；二是检测所需量少，只需200微升；三是检测量大，可以同时检测98个样本，检测效率高等特点。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种简单快速、灵敏度高、能大批量、定量检测血液中亚硝酸盐的方法。

本发明的目的通过以下技术方案予以实现。

除非另有说明，本发明所采用的百分数均为重量百分数。

一种血液中亚硝酸盐的检测方法，包括以下步骤：

（1）亚硝酸盐标准工作曲线的制作

①基体空白溶液的制备：取10 mL不含亚硝酸盐的新鲜加抗凝剂血液，放入离心机中离心，取上清液5 mL，加入由0.2mol/L氢氧化钠溶液1 mL和硫酸锌1 g组成的蛋白沉淀脱色剂, 混合均匀1min，离心分离，取出上清液， 得到几乎无色、透明的基体空白溶液。

②分别取浓度为1.0 µg/mL 的NO₂^- 20、40、60、80、100µL标准溶液于微量试管中，用步骤①制备好的基体溶液稀释至500µL，加入GriessA试剂25µL，混合均匀；1min后加入GriessB试剂25µL，混合均匀。取200µL混匀显色液于酶标板中，在酶标仪波长490nm处测定吸光度，制作工作曲线，得到亚硝酸盐的检测限和线性回归方程；

（2）样品测定

血液的检测：取5 mL新鲜加抗凝剂血液，放入离心机中离心，取上清液2 mL，加入由0.2mol/L氢氧化钠溶液0.4mL和硫酸锌0.4g组成的蛋白沉淀脱色剂, 涡旋混合均匀1min，离心分离，取500µL上清液微量试管中,加入GriessA试剂25µL，混合均匀；1min后加入GriessB试剂25µL，混合均匀。取200µL混匀显色液于酶标板中，在酶标仪波长490nm处测定吸光度，并对照步骤（1）所得的线性回归方程，计算出样品中亚硝酸盐的含量。

其中，步骤（1）（2）中所述的GriessA试剂为50mg对氨基苯磺酸溶于5mL盐酸（0.5mol/L）；GriessB试剂为4mg 1-萘胺 溶于4mL甲醇（50%）；

所述的离心条件为离心时间5～10min，离心速率3000～6000r／min。

相对于现有技术，本发明具有以下显著优点:

1、利用酶标仪替代通用的光度计，检测波长定为几乎所有酶标仪都配的490nm处，检测所需量少，只需200微升，可以同时检测98个样本，检测效率高。