[发明专利]一种减少生物样品背景荧光的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，特别涉及一种减少生物样品背景荧光的方法。

背景技术

落射荧光显微成像是生物研究中最常使用的显微技术之一，其与荧光蛋白（GFP及其衍生物，XFPs）、免疫荧光以及荧光探针标记的方法结合后，在动物学、植物学、微生物学、免疫学、病理学及药学等领域得到了广泛的应用。

然而，落射式荧光成像存在一个非常严重的问题，即背景荧光的干扰，尤其对较厚的生物组织块。背景荧光不仅可能导致错误的有效信号，甚至使得焦面上的信号被湮没。而在生物研究中，常常不仅需要局部的精细结构，更需要针对厚组织块进行大范围的结构追踪。例如脑结构和功能的研究，常常需要对毫米甚至厘米尺寸的小鼠鼠脑进行成像。因此，这种大尺寸样本背景荧光的问题亟待解决。

针对背景荧光干扰，目前有几种解决方式：一种是从成像技术角度消除焦面外荧光信号的影响。常见的解决方式是采用光切片的技术，如共聚焦激光扫描显微镜、多光子显微镜、光片照明及结构光照明显微镜。然而这些方式都存在一定的局限性。比如共聚焦激光扫描显微镜和多光子显微镜采用点扫描方式，成像速度慢、视场小，对大尺寸样本成像时需要耗费较长时间。光片照明显微镜受限于物镜的工作距离，无法使用高NA值的物镜进行成像，导致成像分辨率不高。结构光照明显微镜对噪声如散粒噪声敏感，通过解码算法后散粒噪声大大增加，难以应用于较厚、背景荧光较强的样本。另一种是采用化学手段降低背景荧光。比如在专利U.S.Pat.No.6,221,612中描述了使用多种染料减少细胞溶液中不需要的光发射的方法。对于自发荧光导致的背景荧光，也一直有研究者尝试用各种染色剂来进行去除，如文献“Reduction of lipofuscin-like autofluorescence in fluorescently labeled tissue.(Schnell,S.A.,W.A.Staines and M.W.Wessendorf，Journal of Histochemistry&Cytochemistry47(1999)719-730）”、“Working with GFP in the brain.(Doyle,K.P.,R.P.Simon,A.Snyder,et al.,Biotechniques 34(2003)492-494)”、“Sudan Black B treatment reduces autofluorescence and improves resolution of in situ hybridization specific fluorescent signals of brain sections.(Oliveira,V.C.,R.C.V.Carrara,D.L.C.Simoes,et al.,Histology and Histopathology25,(2010)1017-1024”、“Sudan Black B Reduces Autofluorescence in Murine Renal Tissue.(Sun,Y.,H.Yu,D.Zheng,et al.,Archives of Pathology&Laboratory Medicine135(2011)1335-1342)”。然而，目前的染色方法都局限在细胞溶液或几十微米的切片中，对毫米级甚至厘米级的生物组织块并没有研究。而当样品尺寸增大时，常常导致染色时间慢、染色不均匀、实验流程繁琐等现象。例如硫瑾染色小鼠全脑时染色分色通常需要接近一个月，Golgi-Cox法染色小鼠全脑甚至需要半年。因此，选择一种合适的适用于特定荧光物质的光吸收剂，找到其合适的使用条件，使其快速均匀地渗透到生物组织中，可能也需要大量的研究。

发明内容

本发明的目的是为解决上述问题而提供了一种大大降低生物样品荧光背景，提高荧光成像信号对比度的方法。

本发明所采用的技术方案是：

一种减少生物样品背景荧光的方法，包括以下步骤：

（1）将生物样品用冰水预冷却的质量百分比为4%的多聚甲醛溶液固定6～24h；

（2）将步骤（1）得到的生物样品用冰水预冷却的浓度为0.01mol/L的PBS漂洗液清洗3～24h，其间更换新鲜漂洗液3～5次；

（3）将步骤（2）得到的生物样品依次放入冰水预冷却的质量百分比为50%和70%的乙醇溶液中进行梯度脱水，每次15min～2h；

（4）将步骤（3）得到的生物样品放入苏丹黑B染色液中染色30min～48h；