[发明专利]一种基于分子印迹膜过滤技术的埃博霉素B分离提取方法

说明书

技术领域

本发明属于抗生素分离提取领域，具体地涉及到一种基于分子印迹膜过滤技术的埃博霉素B分离提取方法。

背景技术

埃博霉素B(Epothilone B)是微生物纤维堆囊菌产生的一类大环内酯类次级代谢产物。1994年美国国家癌症学会发现埃博霉素B对肿瘤细胞具有抑制活性，Merck实验室发现它和紫彬醇至少在微管蛋白聚合实验中具有相同作用，证明了埃博霉素对肿瘤细胞有抑制作用的事实，进一步的研究发现埃博霉素具有比紫彬醇优越的抗肿瘤特性，使得研究者把更多的精力投入到对其合成及分离提取上，以期更快的将其开发成为抗肿瘤药物。但是目前公开发表的分离提取埃博霉素B方法步骤繁琐，生产成本高，尚需研究大规模和简单廉价是分离纯化方法。

分子印迹技术以其预定性、识别性和实用性三大特点引起科学界广泛关注。将分子印迹技术与膜分离技术结合起来，制成的分子印迹聚合物膜（Molecular Imprinted Membrane，MIM），兼具分子印迹技术与膜分离技术的优点，一方面，该技术具有便于连续操作、易于放大、能耗低、能量利用率高等优点，被看作是一种“绿色化学”的典型；另一方面，与传统的分子印迹微球材料相比，分子印迹聚合物膜具有材料更稳定，不需研磨等繁琐的制备过程，扩散阻力小，易于应用等独特的优点；另外，与目前商售膜如超滤、微滤及反渗透膜等无法实现单个物质的选择性分离的缺点相比，分子印迹膜的最大特点就是对模板分子的识别具有可预见性，针对性及高度选择性，为将特定目标分子从其结构类似物的混合物中分离出来提供了可行且有效的解决途径。分子印迹膜鉴于以上特点，将其应用到埃博霉素B的分离提取中将具有十分诱人的前景。

经过检索，目前还没有将分子印迹聚合物膜应用到埃博霉素B的分离纯化过程中的相关报道。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种基于分子印迹膜过滤技术的埃博霉素B分离提取方法，其操作简便，选择性高，极大地降低了提纯成本。

为实现上述目的，本发明采用如下的技术方案：

（1）树脂对发酵液进行吸附：将纤维堆囊菌在液体培养基中进行发酵，并向液体培养基中加入经过处理的大孔树脂，发酵结束后，过滤得到吸附树脂；其中，大孔树脂的加入量为液体培养基体积的2-5%；

（2）乙酸乙酯浸提：用乙酸乙酯浸提吸附树脂，收集浸提液；

（3）浸提液的初步过滤：将浸提液首先通过孔径为0.2-0.5um的微滤膜过滤，除去残留的菌体，得到滤液；再将滤液采用截留分子量为1000-5000的超滤膜过滤以去除大分子杂质，收集滤液，得到粗提物；

（4）埃博霉素B分子印迹膜过滤：首先将博霉素B分子印迹聚合物膜固定在透过装置的原料池和透过池之间，向原料池中加入粗提物，透过池中加入乙酸乙酯，将透过装置密封，搅拌下进行15-30min后，收集透过液得到埃博霉素B溶液；

（5）结晶：将埃博霉素B溶液进行真空浓缩，得到浓缩液，再将浓缩液于-20～-10℃下进行结晶，得到白色粉末状结晶，即为埃博霉素B。

所述的步骤（1）中的液体培养基成分为土豆淀粉2.5～3.0g/L，蔗糖0.7～1.0g/L，葡萄糖0.2～0.5g/L，豆饼粉1.7～2.0g/L，MgSO₄·7H₂O 2.3～2.5g/L，CaCl₂3.0～3.5g/L，EDTA-Fe³⁺ 2mL/L，微量元素0.5～1.0mL/L，pH值为7.2；发酵的时间为120-150h。

所述步骤（1）中纤维堆囊菌菌株号为ATCC25532或ATCC25569。

所述步骤（1）中大孔树脂的采用如下方法进行处理：首先，用3～5倍大孔树脂体积的甲醇浸泡大孔树脂，摇床震荡12-16h后，去除甲醇溶液，水洗至无甲醇味；再用甲醇浸泡12-16h后，水洗至无甲醇味；大孔树脂为XAD-16型大孔树脂。

所述步骤（2）中乙酸乙酯的用量为大孔树脂体积的3～5倍，浸提的时间为24-48h。

所述步骤（3）中微滤膜与超滤膜的材质均为醋酸纤维素、聚砜、聚丙烯、聚丙烯腈、聚乙烯醇或聚酰胺。

所述步骤（3）中微滤膜过滤的操作压力为0.1-0.5Mpa，操作温度为0-40℃，控制流速5-10mL/min；超滤膜过滤的操作压力为0.1-0.6MPa，温度0-40℃，控制流速5-10mL/min。