[发明专利]猪传染性胸膜肺炎放线杆菌快速诊断试纸条的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物快速检测技术领域，具体涉及猪传染性胸膜肺炎放线杆菌外溶血毒素ApxI快速诊断试纸条的制备方法。

背景技术

猪传染性胸膜肺炎是由猪胸膜肺炎放线杆菌引起的一种猪的高度接触性传染病，也是当代国际公认危害现代养猪业五大重要传染病之一，也是当今大型养猪场的三大呼吸道传染病之一。在临床剖检上主要以肺出血、坏死和纤维素性渗出为主要病变，急性病例病死率高。本病发病季节明显，在气温较低的冬季、早春晚秋等气候恶劣的时节多发。任何年龄的猪对本病均易感，其中3月龄最易感。感染了胸膜肺炎放线杆菌的猪，在临床上常易继发其他细菌性疾病如副猪嗜血杆菌、多杀性巴氏杆菌等，还有支原体、猪繁殖于呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒(PCV)及伪狂犬病病毒(PRV)等，引起复杂的呼吸道综合症，加重对感染猪只的危害。

猪胸膜肺炎放线杆菌引起猪传染性胸膜肺炎主要与较多的毒力因子有关，包括脂多糖(LPS)、外膜蛋白(OMP)、转铁结合蛋白(TBP)、荚膜(CP)、溶血外毒素(Apx)等这些毒力因子都能引起胸膜肺炎的发生。其中的Apx是一种对肺泡巨噬细胞起毒性作用的物质，可抑制肺泡巨噬细胞的吞噬活性，同时，Apx对外周单核细胞及淋巴细胞也有细胞毒性作用，被认为是引起感染并使肺组织严重损伤的主要原因。Apx分为ApxI、Apx II、ApxIII、ApxIV四种不同型的毒素，ApxI、Apx II、ApxIII是引起疾病临床症状的出现以及典型的肺部病变必需物质，被公认为引起猪传染性胸膜肺炎的主要毒力因子。对临床疾病诊断有重要意义。

ApxI是引起猪传染性胸膜肺炎疾病临床症状的出现以及典型的肺部病变主要毒力因子，但在诊断方法特异性差，很难检测完APP所有血清型，因与其他放线杆菌如猪放线杆菌、罗斯放线杆菌、猪扁桃体放线杆菌等存在交叉反应。而APP所有血清型都分泌ApxIV，ApxIV的种间特异性很强，在其它种属的放线杆菌和其它能分泌ApxI、ApxI毒素的革兰氏阴性杆菌中则均检测不到ApxIV，也可以用以区分疫苗免疫和野毒感染。因此，本发明根ApxI和ApxIV两者之间不同特性，采用胶体金快速免疫层析法，使用两条检测线和一条控制线的试纸条的方法，制备出能检测放线杆菌外溶血毒素中ApxI的快速诊断纸条。

现有技术中，猪传染性胸膜肺炎放线杆菌检测试纸条存在检验速度慢、灵敏度低、操作复杂等缺点。

发明内容

本发明提供猪传染性胸膜肺炎放线杆菌外溶血毒素ApxI快速诊断试纸条的制备方法，解决了现有技术中存在的检验速度慢、灵敏度低、操作复杂等问题。

为解决上述问题，本发明采用如下技术方案：猪传染性胸膜肺炎放线杆菌外溶血毒素ApxI快速诊断试纸条的制备方法，包括分析膜5和金标抗体结合垫1，分析膜5上用抗放线杆菌外毒素ApxI/ApxIV单克隆抗体做为检测线T1和检测线T2以及羊抗兔IgG做为质控线C，金标抗体结合垫1上是p380-ApxI-ApxIV的融合蛋白抗兔多克隆抗体。

抗猪传染性胸膜肺炎放线杆菌外毒素ApxI/ApxIV单克隆抗体通过杂交融合技术方法，筛选出猪传染性胸膜肺炎放线杆菌外毒素ApxI/ApxIV单克隆抗体的杂交瘤细胞株而获得；融合蛋白抗兔多克隆抗体通过p380-ApxI-ApxIV的融合蛋白可溶性抗原多次免疫新西兰大白兔而获得。

分析膜5的材料为硝酸纤维膜，金标抗体结合垫1的材料为玻璃纤维膜。

快速诊断试纸条的制备方法，包括以下步骤：

(1)pSE380-ApxI-ApxIV融合蛋白的多克隆抗体制备：选择健康成年公兔(2-3月龄，2-3kg)做免疫动物，将纯化的His-ApxI-Apx IV融合蛋白重组蛋白与弗氏完全佐剂等体积混合乳化，进多次免疫动物获得免疫血清。

(2)pSE380-ApxI、pSE380-ApxIV融合蛋白的单克隆抗体制备：将融合蛋白pE380-ApxI、pE380-ApxIV注入Balb/c小鼠中，再采用细胞融合技术进行杂交瘤阳性克隆筛选，筛选出阳性杂交瘤进行体外和体内培养获得单克隆抗体。

(3)制备分析膜5：将步骤(1)制备的抗猪传染性胸膜肺炎放线杆菌外毒素ApxI/ApxIV在硝酸纤维膜上形成检测线T1和检测线T2，羊抗兔IgG在硝酸纤维膜上形成质控线C，以供备用。

(4)制备金标抗体结合垫1：采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金溶液，并采用标记体系标记pSE380-ApxI-ApxIV融合蛋白的多克隆抗体，将金标抗体在与支持膜上固相化。