[发明专利]以组氨酸和色氨酸基团联合对烟草花叶病毒壳蛋白模板进行结构修饰的方法

权利要求书

1.一种以组氨酸和色氨酸基团联合对烟草花叶病毒壳蛋白（TMVCP）模板进行结构修饰的方法，其特征在于：在以组氨酸（His）修饰的基础上，引入色氨酸（Trp）基团，进一步进行修饰，具体步骤如下：

以His修饰的TMVCP表达质粒His-TMVCP作为模板，分别以Trp-TMVCP F1, CATATGCATCATCATCATCATCATTCTTACAGTATCACTAC, 和 Trp-TMVCP R1, CCATGGTTACCAAGTTGCAGGACCAGAGGTC作为上、下游引物，进行PCR扩增，PCR扩增产物随后经NdeI和NcoI双酶切，使用T4DNA连接酶连接进入pET20b载体，提取质粒DNA，并送测序，随后产物被亚克隆进原核表达菌株Rosetta中进行蛋白表达；

随即将含有宿主质粒的Rosetta原核表达菌株，置于Luria-Bertani（LB）培养基中，持续震荡摇菌， 直至达到规定的OD值，而后以SDS-PAGE分离细菌裂解液的方法评估蛋白表达情况；

收取全部菌液，将其重悬于裂解缓冲液中，全部重悬细菌产物加入Buster、Lysonase试剂以及一定量的RNA、DNA酶，在一定的苯甲基磺酰氟（PMSF）浓度下进行震荡，而后加入预冷的平衡缓冲液，经冰浴后离心，取上清与镍树脂充分混合而后孵育过夜;

上柱纯化时，首先使液体自然流出蛋白纯化柱，然后分别以预冷缓冲液、冲洗缓冲液冲洗柱子，最后使用洗脱缓冲液来洗脱目标蛋白。

2.根据权利要求1所述的以组氨酸和色氨酸基团联合对烟草花叶病毒壳蛋白（TMVCP）模板进行结构修饰的方法，其特征在于：以His修饰的TMVCP表达质粒His-TMVCP是通过以下方法准备而成的：（1）两条引物被用来扩增TMV外壳蛋白（WT-TMV-CP），上游引物TMVCP F1，GATTCGTTTTACATATGTCTTACAGTATVACTAC，和下游引物His-TMV-CP R1，TAGTACCATGGTCATTAGTGATGGTGATGGTGATGAGTTTGCAGGACCAGAGGTC；（2）PCR产物使用T4DNA连接酶连接进入pET28a载体；（3）在羧基端含有6*His 标签的含有确定DNA序列的His-TMV-CP质粒被亚克隆进原核表达菌株Rosetta中进行蛋白表达；（4）上柱纯化蛋白时，首先以50 mL预冷缓冲液冲洗柱子，随后，再以冲洗缓冲液-40冲洗柱子，最后，使用洗脱缓冲液来洗脱目标蛋白。

3.根据权利要求1所述的以组氨酸和色氨酸基团联合对烟草花叶病毒壳蛋白（TMVCP）模板进行结构修饰的方法，其特征在于：所述规定的OD值为0.5-0.6。

4.根据权利要求1所述的以组氨酸和色氨酸基团联合对烟草花叶病毒壳蛋白（TMVCP）模板进行结构修饰的方法，其特征在于：所述一定量的RNA、DNA酶为5-7个单位的RNA、DNA酶。

5.根据权利要求1所述的以组氨酸和色氨酸基团联合对烟草花叶病毒壳蛋白（TMVCP）模板进行结构修饰的方法，其特征在于：步骤（3）中是在1 mM苯甲基磺酰氟（PMSF）中以200~250 rpm震荡20~40 分钟。

6.根据权利要求1所述的以组氨酸和色氨酸基团联合对烟草花叶病毒壳蛋白（TMVCP）模板进行结构修饰的方法，其特征在于：所述平衡缓冲液的用量为30ml，具体成分为：50 mM磷酸钾，300 mM氯化钾，1 mM PMSF，10 mM β-巯基乙醇，10 mM咪唑，10%乙醇，PH值8.0。

7.根据权利要求1所述的以组氨酸和色氨酸基团联合对烟草花叶病毒壳蛋白（TMVCP）模板进行结构修饰的方法，其特征在于：所述预冷缓冲液的用量50ml，预冷温度4°C，具体成分为：50 mM磷酸钾，300 mM氯化钾，1 mM PMSF，10 mM β-巯基乙醇，10 mM咪唑，10%乙醇，PH值8.0。

8.根据权利要求1所述的以组氨酸和色氨酸基团联合对烟草花叶病毒壳蛋白（TMVCP）模板进行结构修饰的方法，其特征在于：所述冲洗缓冲液的具体成分为：50 mM磷酸钾，300 mM氯化钾，1 mM PMSF，10 mM β-巯基乙醇，40 mM咪唑，10%乙醇，PH值8.0。

9.根据权利要求1所述的以组氨酸和色氨酸基团联合对烟草花叶病毒壳蛋白（TMVCP）模板进行结构修饰的方法，其特征在于：所述洗脱缓冲液的具体成分为：50 mM磷酸钾，300 mM氯化钾，1 mM PMSF，10 mM β-巯基乙醇，500mM咪唑，10%乙醇，PH值8.0。