[发明专利]CTB、人胰岛素和谷氨酸脱羧酶3p531片段融合蛋白及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物药物开发技术领域，具体涉及一种CTB、人胰岛素和谷氨酸脱羧酶3p531片段融合蛋白及其应用。

背景技术

糖尿病是一种由胰岛素分泌缺陷或胰岛素作用障碍所导致的以血糖高为特征的代谢性疾病，目前已经成为世界上影响人体健康的重大疾病之一。糖尿病分为Ⅰ型和Ⅱ型，其中，Ⅰ型糖尿病（胰岛素依赖性糖尿病，IDDM）是由于胰岛β细胞受到破坏导致胰岛素分泌缺陷的自身免疫性疾病，而Ⅱ型糖尿病患者体内分泌胰岛素的能力并未完全丧失，有的患者体内胰岛素甚至产生过多，但胰岛素的作用效果较差，导致体内胰岛素相对缺乏。

Ⅰ型糖尿病占全国糖尿病总数的5-10%，全国Ⅰ型糖尿病的患者至少有100万，目前还呈上升趋势。Ⅰ型糖尿病患者必须长期服用胰岛素以维持生命，给家庭和社会带来了严重的精神压力和经济负担，且糖尿病引起的各种并发症是导致残疾和死亡的主要原因，因此糖尿病的防治迫在眉睫。

现有技术中治疗糖尿病的药物多数针对Ⅱ型糖尿病，用于治疗Ⅰ型糖尿病的药物则相对较少。

Ⅰ型糖尿病的抗原包括胰岛素及其前体、谷氨酸脱羧酶（Glutnmic acid decarnoxylase，GAD）蛋白、热休克蛋白、羧基肽酶H等多种抗原。研究表明，仅给动物口服一种自身抗原如胰岛素，就能诱导免疫耐受，对机体产生保护作用（Science,1994,265:1237）。这是由于口服抗原能够诱导调节性T细胞分泌抑制性细胞因子IL-4、IL-10和TGF-β，降低自身免疫疾病病灶由IL-2、IFN-γ和TNF-α导致的炎症反应。这种由相互间无关的各种抗原诱导的，在同一特定器官发生的所有病理免疫反应进行抑制，被称为抗原驱动旁观者抑制（Antigen-driven Bystander Supression）。抗原驱动旁观者抑制的诱导是抗原特异性的，而效应是非特异性的，这为防预Ⅰ型糖尿病等自身免疫性疾病提供了一条新途径(Immunol Today,1998,19:173)。

同时，研究表明霍乱病毒B亚基（CTB）可作为诱导口服耐受的强大粘膜运载系统，并且CTB偶联抗原可能涉及到与传统大量口服自身抗原产生免疫耐受效应明显不同的免疫调节机制，可能涉及到发炎细胞的移动行为的变化（Nat Biotechnol,1998,16,292），暗示CTB偶联自身抗原不仅使应用口服耐受防治Ⅰ型糖尿病等自身免疫性疾病更具实际应用价值，而且还有潜在的治疗前景（Proc Natl Acad Sci USA,1997,94:4610）。

发明内容

本发明提供了一种融合基因，该融合基因表达的融合蛋白可用于制备Ⅰ型糖尿病治疗药物。

一种融合基因及其表达的融合蛋白，所述融合基因由CTB基因、人胰岛素基因和谷氨酸脱羧酶基因3p531片段（即三倍的谷氨酸脱羧酶65分子第531-545位氨基酸序列）重组而成，所述融合蛋白由CTB、人胰岛素和谷氨酸脱羧酶3p531片段（即三倍的谷氨酸脱羧酶65分子第531-545位氨基酸序列GAD653(531-545)）融合而成。

谷氨酸脱羧酶基因全长序列过长，融合过后会影响融合蛋白的表达量，因此本发明中选用三倍的谷氨酸脱羧酶65基因的531-545片段，p531片段是谷氨酸脱羧酶的核心抗原片段，既不会影响融合蛋白的表达量，又能很好地与人胰岛素一起诱导免疫耐受。

作为优选，所述融合基因的碱基序列如SEQ ID No.1所示；如SEQ ID No.1所示融合基因的制备方法为：

（a）以pBac-CTB-INS质粒为模板，以aF/aR为引物进行扩增，获得目的片段CTB-INS-GPGP；

上游引物aF的碱基序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物aR的碱基序列如SEQ ID NO.4所示；

（b）以pBac-CTB-3p531质粒为模板，以bF/bR为引物进行扩增，获得目的片段GPGP-3p531；

上游引物bF的碱基序列如SEQ ID NO.5所示，下游引物bR的碱基序列如SEQ ID NO.6所示；

（c）以CTB-INS-GPGP和GPGP-3p531互为引物和模板进行链延伸反应，获得产物S1，以S1为模板，以aF/bR为引物进行扩增，获得融合基因CTB-INS-3p531。

由SEQ ID No.1所示的融合基因表达的融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。