[发明专利]筛选草甘膦N-乙酰转移酶抗血清的试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种筛选草甘膦N-乙酰转移酶抗血清的试剂盒，也涉及一种草甘膦N-乙酰转移酶抗血清的制备方法及其应用。

背景技术

草甘膦(glyphosate)是一种广谱灭生性、内吸传导型优秀除草剂，由于其具有低成本、高效率、易降解及环境影响小等特点而在农业生产中被广泛使用。

草甘膦的靶标酶是莽草酸途径（shikimate pathway）中的5-烯醇丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合成酶（5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase,EPSPS）(Amrhein et al,1980;Steinrucken and Amrhein,1980)。草甘膦是莽草酸途径中5-磷酸烯醇式丙酮酸(phosphoenol pyruvate,PEP)的类似物，二者分子结构极为相似。在莽草酸途径中，草甘膦同PEP竞争EPSPS。草甘膦的竞争力强导致PEP的烯醇基团不能与莽草酸三磷酸(Shikimat-3-phosphate,S3P)结合，不能形成5-烯醇丙酮酰-莽草酸-3-磷酸(5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase,EPSP)；最终抑制了莽草酸向苯丙氨酸(phenylalanine,Phe)、酪氨酸(tyrosine,Tyr)及色氨酸(trypotophan,Trp)的转化。氨基酸是植物体内必不可缺少的物质，在蛋白质合成和植物的初级、次生代谢中起着重要的作用。一旦氨基酸的合成受到阻碍，就会影响植物的代谢，严重时会导致植物死亡。而莽草酸途径是合成苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的唯一途径，该途径被草甘膦切断后，植物会很快死亡(Dill et al.,2010)。

草甘膦N-乙酰转移酶（glyphosate N-acetyhransferase，GAT）能将草甘膦乙酰化生成乙酰草甘膦，从而使草甘膦失去除草剂活性。利用草甘膦乙酰化解毒可以避免草甘膦在植物体内的积累，使得草甘膦在作物的整个生长周期都可使用，而不受生长发育阶段的限制，同时也能耐受更高的草甘膦浓度。Castle等首先从地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）中克隆到有弱草甘膦N-乙酰转移酶活性的基因，通过DNA shuffling的方法优化得到有强降解草甘膦能力的基因（Castle et al,2004,2010）。在我国，顿宝庆等以受到草甘膦长期极端污染的土壤总DNA为材料，得到一个高抗草甘膦的基因，GAT（顿宝庆等，2006）。Jin等研究了该基因中与草甘膦抗性相关的核苷酸突变位点，并通过DNA改组的方法获得了有很高活性的GAT（Jin et al,2006），这是拥有我国自主知识产权的基因。

发明内容

本发明的一个目的是提供草甘膦N-乙酰转移酶的应用。

本发明提供的草甘膦N-乙酰转移酶在制备抗草甘膦N-乙酰转移酶血清中的应用；

所述草甘膦N-乙酰转移酶为如下1）或2）：

所述草甘膦N-乙酰转移酶的氨基酸序列为如下1）或2）：

1）序列表中的序列2自N端第114-260位氨基酸残基；为草甘膦N-乙酰转移酶；

2）序列表中的序列2，为N端融合His标签和叶绿体导肽的草甘膦N-乙酰转移酶。

在本发明的实施例中，采用的草甘膦N-乙酰转移酶为N端融合His标签和叶绿体导肽的草甘膦N-乙酰转移酶。

上述应用中，所述草甘膦N-乙酰转移酶通过原核表达得到的蛋白。

本发明的第二个目的是提供一种制备抗草甘膦N-乙酰转移酶血清的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：

1）将草甘膦N-乙酰转移酶编码基因导入宿主菌进行原核表达，得到草甘膦N-乙酰转移酶；

2）将所述草甘膦N-乙酰转移酶免疫兔，收集血清，即得到抗草甘膦N-乙酰转移酶血清。

上述方法中，步骤1）中，所述草甘膦N-乙酰转移酶编码基因通过重组载体导入宿主菌进行原核表达。

上述方法中，所述重组载体为将所述草甘膦N-乙酰转移酶编码基因插入表达载体中，得到表达草甘膦N-乙酰转移酶的重组载体。

上述方法中，所述表达载体为pET28a。

上述方法中，所述草甘膦N-乙酰转移酶编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列1自5′末端第109-780位核苷酸。