[发明专利]羰基还原酶、其基因及用于度洛西汀手性中间体的制备

说明书

技术领域

本发明涉及一种新的基因及其蛋白质产物，具体涉及一种来源于金黄杆菌（Chryseobacterium sp.CA49）的新型羰基还原酶ChKRED15及其基因，并利用这种羰基还原酶作为生物催化剂制备度洛西汀手性中间体，属于应用微生物与酶工程领域。 

背景技术

度洛西汀是第三代抗抑郁药，是市场销售最主要的抗抑郁药，能有效地抑制5-羟色氨和去甲肾上腺素的再摄取(Wong DT,et al.Life Sci,1988,43:2049-2057)，高效、安全、副作用小，对其他症状如全身疼痛和胃肠道紊乱也有疗效(Bymaster FP,et al.Neuropsychopharmacology,2001,25:871-880)。该药还被批准用于糖尿病引起的神经疼痛以及女性尿失禁的治疗(Norton PA,et al.Am J Obstet Gynecol,2002,187:40-48)。 

度洛西汀含有一个手性中心，研究表明仅(S)构型的对映体具有药物活性。(S)-度洛西汀的合成关键步骤为(S)构型手性醇中间体的获得。目前对(S)构型手性醇中间体的获得主要通过化学途径，但存在诸多问题，如化学拆分需要使用大量的拆分剂，反应步骤长，能耗高以及废物排放量大等；基于过渡金属手性配体催化氢化体系，由于产品光学纯度不高以及重金属残留等问题，导致其难以应用于医药中间体的生产。 

与化学方法相比，生物催化过程具有高度的化学、区域和立体选择性，反应条件温和，后处理容易，能耗较低，是一种环境友好的合成方法，也是当今化工生产和相关领域发展一大潮流。其中生物催化不对称还原已经发展成为全球各大医药公司研发部门的重要组成部分。然而，迄今为止的绝大部分研究集中于苯基酮为骨架的底物，而以杂芳环酮为骨架的底物研究较少见，其中与度洛西汀手性中间体合成相关的更是屈指可数(Wada M,et al.Biosci Biotechnol Biochem,2004,68:1481-1488;Stürmer R,et al.,2008,US0318288A1;Tang CG,et al.Biotechnol Lett,2011,33:1435-1440)。其中，汤传根等（Tang CG,et al. Biotechnol Lett,2011,33:1435-1440)2011年报道了粘红酵母菌（Rhodotorula sp.CY12）催化杂芳环酮为骨架的底物N-甲基-3-羰基-3-(2-噻吩基)丙酰胺生成(S)-度洛西汀关键醇中间体合成路线，该工艺以原始菌休止细胞为生物催化剂，48h内可转化底物浓度为30g/l，为(S)-度洛西汀关键醇中间体提供了一种可选择方法。为该底物筛选更多优良催化剂可进一步丰富生物催化工具箱，发掘更多有潜力的备用酶源。 

发明内容

本发明公开了一种来源于金黄杆菌（Chryseobacterium sp.CA49）的羰基还原酶ChKRED15及其基因，并提供了该酶异源表达体系的构建方法以及该酶作为生物催化剂用于制备度洛西汀手性中间体的方法。 

羰基还原酶ChKRED15的基因的核苷酸序列（738bp）为SEQ ID No.1所示。 

羰基还原酶ChKRED15基因编码的蛋白质（245aa）的氨基酸序列为SEQ ID No.2所示。 

羰基还原酶ChKRED15从金黄杆菌（Chryseobacterium sp.CA49）基因组中克隆获得，该菌的保藏编号为CCTCC M2012484（中国武汉，中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2012年11月27日）。 

通过设计如下引物：正向：5′-GCG GAATTC ATG AAA ACA GTA TTA ATT ACA GGC GCC-3′（酶切位点：EcoRⅠ）；反向：5′-GCG AAGCTT CTA CCA CGG ACT GAT TCC GG-3′（酶切位点：Hind III），以金黄杆菌（Chryseobacterium sp.CA49）基因组DNA为模板，经PCR扩增获得目标基因，该基因编码的蛋白质命名为羰基还原酶ChKRED15。将目标基因连入pET28a(+)载体，并转入E.coli BL21（DE3），构建pET28a(+)-BL21异源表达体系。异源表达产物经纯化后得到纯酶。