[发明专利]一种基于亲水固相萃取技术的蟾蜍二烯内酯类化合物类分离纯化方法

说明书

技术领域

本发明涉及蟾蜍二烯内酯类化合物的类分离纯化，具体地说是一种新型的亲水固相萃取柱（Click XIon）联合高效液相色谱选择性类分离蟾蜍二烯内酯类化合物的纯化制备方法。该方法对氨基酸修饰的蟾蜍二烯内酯类化合物和非氨基酸修饰的蟾蜍二烯内酯类化合物表现出较优的分离效果。

背景技术

蟾蜍二烯内酯（bufadienolides）是一类C24甾，并且在甾体母核的C17位接有β六元不饱和内酯环，该类化合物也常被称为蟾蜍二烯内酯。Liselotte.Krenn,Pieter S.Steyn和高慧敏等分别对蟾蜍二烯内酯类化合物具有的生物活性进行了综述。这些活性主要包括局麻、强心、升压、Na⁺/K⁺-ATP酶抑制活性及抗肿瘤等作用（L.Krenn,B.Kopp,Bufadienolides from animal and plant sources,Phytochemistry,48(1998)1-29.；P.S.Steyn,Fanie R.van Heerden,Bufadienolides of plant and animal origin,Nat.Prod.Rep,15(1998)397-413.；H.Gao,R.Popescu,B.Kopp,Z.Wang,Bufadienolides and their antitumor activity,Nat.Prod.Rep.,28(2011)953-969.）。另外，此类蟾蜍二烯内酯类成分中的许多化合物都具有较高的毒性和较严重的副作用，给使用者带来一定的安全隐患，从而制约了此类制剂的使用（D.Wang,F.Qi,W.Tang,F.Wang,Chemical Constituents and Bioactivities of the Skin of Bufo bufo gargarizans Cantor,Chem.Biodivers.,8(2011)559-567.）。从天然产物（蟾蜍皮、蟾酥）中分离纯化是获得蟾蜍二烯内酯单体的主要途径。由于蟾蜍二烯内酯类化合物数量多、结构复杂，常规的分离纯化方法较为耗时、低效(L.Krenn,B.Kopp,Bufadienolides from animal and plant sources,Phytochemistry,48(1998)1-29.)。由于氨基酸修饰的蟾蜍二烯内酯和非氨基酸修饰的蟾蜍二烯内酯类化合物疏水性相似，在反相高效液相纯化制备时常常出现共流出现象，给分离纯化带来一定的困难。因此，发展较为高效的方法从蟾蜍皮中分离出高纯度的蟾蜍二烯内酯类化合物进而开展相关药理毒理方面的研究是十分迫切的。

发明内容

本发明提供了一种基于亲水固相萃取技术的蟾蜍二烯内酯类化合物类分离纯化方法。

基于亲水条件下，氨基酸修饰的蟾蜍二烯内酯类化合物和非氨基酸修饰的蟾蜍二烯内酯类化合物亲水性质的不同，我们采用亲水固相萃取柱联合半制备反相色谱柱发展了一种选择性类分离蟾蜍二烯内酯类化合物的纯化方法。其中所述亲水色谱柱为两性离子柱（Click XIon，北京华谱新创科技有限公司）。流动相组成为乙腈、甲醇、乙醇、甲酸、乙酸、三氟乙酸、水。采用线性梯度、台阶梯度或等度洗脱方式。选取蟾蜍皮95%乙醇提取物反相色谱制备分离所得的一个馏分，采用Click XIon亲水固相萃取柱分成氨基酸修饰的蟾蜍二烯内酯类组分和非氨基酸修饰的蟾蜍二烯内酯类组分，通过反相色谱对两组分分别制备，共获得七个化合物，其中两个为氨基酸修饰的蟾蜍二烯内酯，另外五个为非氨基酸修饰的蟾蜍二烯内酯。所述化合物的结构信息见式1、表1。

式1氨基酸修饰的蟾蜍二烯内酯（1-2）和非氨基酸修饰的蟾蜍二烯内酯（3-7）的结构式

表1纯化制得的7个蟾蜍二烯内酯类化合物信息

所述化合物具体制备方法为：