[发明专利]一种获得中华大节竹SOS1逆向转运蛋白编码基因序列的方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，尤其涉及一种获得中华大节竹SOS1逆向转运蛋白编码基因序列的方法。

背景技术

目前，一些竹类植物具有一定的耐盐性。了解竹类植物的抗盐机理，克隆抗盐基因并转移到盐敏感的植物中，培育抗盐的转基因作物新品种，对于竹类植物作为滨海地区防护林来说，具有十分重要的意义。

质膜型Na⁺/H⁺逆向转运蛋白负责Na⁺的外排，将细胞质中的Na⁺逆向运送到胞外高Na⁺环境中，保持细胞中Na⁺的平衡，防止Na⁺对细胞质中细胞器的伤害。植物中Na⁺/H⁺antiporter最早发现是在大麦质膜上，此在大麦质膜上首次发现后，一些植物的质膜型Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因都已被克隆和鉴定，其中包括水稻SOS1、拟南芥AtSOS1、小麦TaSOS1、大叶补血草LgSOS1、番茄LeSOS1等。同时，转SOS1基因能提高转基因植株拟南芥的耐盐性。

耐盐植物在形成了各种潜在抗盐机制，而一些竹类植物具有一定的耐盐性包括刚竹、白哺鸡竹、早竹、红竹、淡竹等，其相关耐盐基因在耐盐品种的抗盐机制中起到关键作用。

云南竹类资源最为丰富，中华大节竹(Indosasa sinica)在云南河口天然竹林的面积约为8580多公顷，开发潜力很大。中华大节竹具有一定的耐盐性，产于贵州南部，云南南部和东南部、广西多生于低海拔地区。叶片通常为带状披针形。但对中华大节竹的耐盐机制尚未从分子水平加以研究。

发明内容

本发明实施例的目的在于提供一种获得中华大节竹SOS1逆向转运蛋白编码基因序列的方法，旨在解决现有缺少中华大节竹的耐盐机制从分子水平研究的问题。

本发明实施例是这样实现的，一种获得中华大节竹SOS1逆向转运蛋白编码基因序列的方法，该获得中华大节竹SOS1逆向转运蛋白编码基因序列的方法包括以下步骤：

步骤一，提取中华大节竹幼苗的根、茎和叶的总RNA，混合RNA后，反转录合成第1链cDNA；

步骤二，用拟南芥和水稻等模式植物的SOS1基因序列，根据保守区域的序列设计简并引物IsSOS1-F1和IsSOS1-R1，以反转录合成第1链cDNA为模板，进行PCR扩增；

步骤三，PCR加样总体系为50μL：cDNA模板为1.0μL，上和下游引物10μmol/L分别为1μL，10×Buffer Mg2⁺为5μL，dNTPs Mixture10mmol/L为4μL，ExTaq DNA聚合酶5U/μL为0.5μL，最后补37.5μL的灭菌水；通过PCR的扩增，获得了700bp的中间片段；

步骤四，利用SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit试剂盒中已知的引物，根据中间片段设计特异引物IsSOS1-3′和IsSOS1-5′，分别进行3′RACE和5′RACE的扩增，通过巢式PCR分别获得3′和5′片段；

步骤五，用Vector NTI12软件拼接中间、3′和5′片段，拼接出IsSOS1基因全长cDNA序列，根据拼接出的全长序列，设计特异引物IsSOS1-F2和IsSOS1-R2通过PCR扩增，PCR扩增后获得含有IsSOS1基因全长编码框的cDNA序列。

进一步，cDNA序列包含3105bp的开放阅读框，同时编码1035个氨基酸残基，序列含有起始密码子ATG和终止密码子TGA。

进一步，该获得中华大节竹SOS1逆向转运蛋白编码基因序列的全长为3516bp，开放读码框为3105bp，编码了1035个氨基酸多肽。