[发明专利]一种蟾蜍二烯内酯类化合物选择性分离纯化方法

说明书

技术领域

本发明涉及蟾蜍二烯内酯类化合物的分离纯化，具体地说是一种反相色谱采用带正电荷的XCharge C18柱在低pH条件下高选择性地分离纯化蟾蜍二烯内酯类化合物的新方法。该方法对氨基酸修饰的蟾蜍二烯内酯类化合物和非氨基酸修饰的蟾蜍二烯内酯类化合物表现出较优的分离效果。

背景技术

蟾蜍二烯内酯（bufadienolides）是一类C24甾，并且在甾体母核的C17位接有β六元不饱和内酯环，该类化合物也常被称为蟾蜍二烯内酯。Liselotte.Krenn,Pieter S.Steyn和高慧敏等分别对蟾蜍二烯内酯合物具有的生物活性进行了综述。这些活性主要包括局麻、强心、升压、Na⁺/K⁺-ATP酶抑制活性及抗肿瘤等作用（L.Krenn,B.Kopp,Bufadienolides from animal and plant sources,Phytochemistry,48(1998)1-29.；P.S.Steyn,Fanie R.van Heerden,Bufadienolides of plant and animal origin,Nat.Prod.Rep,15(1998)397-413.；H.Gao,R.Popescu,B.Kopp,Z.Wang,Bufadienolides and their antitumor activity,Nat.Prod.Rep.,28(2011)953-969.）。另外，此类蟾蜍二烯内类成分中的许多化合物都具有较高的毒性和较严重的副作用，从而制约了此类制剂的使用（D.Wang,F.Qi,W.Tang,F.Wang,Chemical Constituents and Bioactivities of the Skin of Bufo bufo gargarizans Cantor,Chem.Biodivers.,8(2011)559-567.）。并对使用者带来一定的安全隐患。从天然产物（蟾蜍皮、蟾酥）中分离纯化是获得蟾蜍二烯内酯单体的主要途径。由于蟾蜍二烯内酯类化合物数量多、结构复杂，常规的分离纯化方法较为耗时、低效(L.Krenn,B.Kopp,Bufadienolides from animal and plant sources,Phytochemistry,48(1998)1-29.)。然而，由于此类化合物的本身的结构复杂性和数目的繁多，关于此类化合物的药效理，目前的认识还是远远不够的。因此，采用较为系统的高效的方法从蟾蜍皮中分离出高纯度的蟾蜍二烯内酯类化合进而开展相关药理毒理方面的研究是十分迫切的。

发明内容

本发明涉及一种蟾蜍二烯内酯类化合物选择性分离纯化方法。

基于低pH值条件下，氨基酸修饰的蟾蜍二烯内酯类化合物和非氨基酸修饰的蟾蜍二烯内酯类化合物的离子性质的不同，我们采用带正电荷的XCharge C18柱发展了一种新型的高选择性的高效液相色谱法。流动相组成为乙腈、甲醇、乙醇、甲酸、乙酸、三氟乙酸、水，无缓冲盐添加，便于样品制备后处理。其中所述的带正电荷的柱子为混合模式柱（XCharge C18，北京华谱新创科技有限公司）。色谱操作参数如下：色谱柱内径为4.6-100mm；样品浓度为1mg/mL^-1-1g/mL；进样量为1μL-40mL；流速为1-480mL/min；柱温为10-60℃。所述流动相组成为乙腈-酸-水、甲醇-酸-水、乙醇-酸-水；其中酸可以是以下酸中的一种或几种：甲酸、乙酸、丙酸、三氟乙酸。在该纯化体系中从蟾蜍皮提取物中制备获得两组八个蟾蜍二烯内酯化合物。所述化合物的结构信息见式1、表1。

式1氨基酸修饰的蟾蜍二烯内酯（1-4）和非氨基酸修饰的蟾蜍二烯内酯（5-8）的结构式

表1纯化制得的8个蟾蜍二烯内酯类化合物信息

一种蟾蜍二烯内酯类化合物选择性分离的纯化方法，

1）蟾蜍皮乙醇提取物先经制备型RPLC分离，水（A）和甲醇（B）流动相体系；洗脱梯度为体积浓度25%→100%B（V/V）；按各色谱峰的保留时间分别收集各馏分，每个组分浓缩至干后备用；

2）针对富含蟾蜍二烯内酯的组分F13，分离过程中F13组分对应的流动相中甲醇的体积浓度为57%-58.3%，采用半制备反相色谱进行进纯化制备，色谱柱为XCharge C18柱；采用乙腈-酸水溶液、甲醇-酸水溶液或乙醇-酸水溶液流动相体系，对F13进行选择性地分离和化合物制备。