[发明专利]一种克隆猪Sox6基因编码区全序列的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其是一种克隆猪Sox6基因编码区全序列的方法。

背景技术

肌纤维是肌肉的基本组成单位。根据其代谢特点，肌纤维分为有氧代谢型（红肌纤维）和酵解代谢型（白肌纤维），根据其收缩特性，肌纤维分为慢肌纤维（Ⅰ型纤维）和快肌纤维（Ⅱ型纤维）。红肌纤维多为慢肌纤维，而白肌纤维多为快肌纤维。肌纤维数目在动物出生时已经稳定，但其类型在出生后易受内因和外因影响而发生转化。肌纤维类型与畜禽肉品质密切相关，提高Ⅰ型肌纤维在肌肉中的比例可有效地改善畜禽肉品质。

Sox6是转录因子Sox基因家族的重要成员，存在于多种组织中，并以骨骼肌中的含量最丰富，且快肌多于慢肌。人工突变或缺失Sox6基因的动物，其慢肌纤维相关基因表达水平显著提高，Ⅰ型肌纤维在肌肉中的比例明显增加，肌肉颜色鲜红。因此，Sox6在肌纤维类型转化中发挥了重要的作用。

反转录：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，在逆转录酶以及Oligo(dT)和/或随机引物的作用下反转录成cDNA。

简并PCR克隆未知基因编码区全序列：根据已知的其他物种该基因编码区序列，分别在包含起始密码子和终子密码子处设计并合成多条不同核苷酸序列组成的混合引物（简并引物），再以反转录产物（cDNA）为模板，以简并引物为引物，进行PCR扩增，将纯化的PCR产物与T载体连接，连接产物经化学法转化到大肠杆菌后涂布于含相应抗生素的固体LB平板，倒置于生化培养箱37℃培养过夜，随机挑取几个长出的单菌落进行划线培养，经菌落PCR（直接以菌体热解后暴露的DNA为模板进行PCR扩增）初步鉴定后，提取该菌落的质粒进行DNA序列测定。克隆到T载体并转化大肠杆菌后不仅可以将含有目的片段的质粒以保存菌种的方式长期保存，在需要时可利用大肠杆菌大量复制该质粒，还可以克服PCR产物测序时测序引物近端的碱基无法通过测序获得的缺点。该技术仅需知晓相近物种某基因编码区序列，便可快速获得未知的其他物种该基因编码区全序列。该技术成功的关键是简并引物和PCR扩增条件。

在知晓某基因cDNA片段但不知晓其编码区全序列的情况下，可以采用cDNA末端快速扩增（RACE）技术获得其编码区全序列。RACE是基于PCR技术基础上由已知的一段cDNA片段，通过往5’端和3’端延伸扩增从而获得完整的基因5’非翻译区、编码区和3’非翻译区的方法。采用RACE技术来获得基因编码区全序列，成本高、周期长、工作量大、PCR产物片段长度不明确、技术难度大。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种简单、快捷的获取猪Sox6基因编码区全序列的方法，填补了该基因在猪上的空白，为进一步研究猪Sox6功能及应用奠定了基础。

本发明采用以下技术方案：

1.一种克隆猪Sox6基因编码区全序列的方法，包括以下步骤：

A1、提取猪背最长肌中的总RNA，将其反转录成cDNA；

A2、引物的设计及PCR反应：根据已知的小鼠、大鼠和人的Sox6编码区序列，设计一对简并引物，上游引物自起始密码子处设计，下游引物至终止密码子处设计，设计的引物为：

上游引物（pSOX6CDSF）：5’-ATGTCTTCCAAGCAAGCCACCTCTCC-3’

下游引物（pSOX6CDS R）：5’-TCAGTTGGCACTGACAG(C/G)(T/C)TC(T/C)GGG-3’

PCR反应体系为50μL[ddH₂O27μL，10×LAPCR Buffer Ⅱ（Mg2⁺ free）5μL，dNTP mixture（2.5mM each）8μL，MgCl₂（25mM）5μL，上下游引物（10μM）各2μL，cDNA（模板）0.5μL，TaKaRa LA Taq（5units/μL）0.5μL]。PCR反应条件均为95℃预变性3min，然后进行95℃30s，55℃30s，72℃3min，共35个循环，最后再72℃延伸10min。

A3、PCR产物的回收和纯化；

A4、克隆。